qpcr演算法失敗

⑴ PCR的反應包括三個主要步驟

PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：

1、模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

2、模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

3、延伸：DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴於DNA聚合酶。該步驟時間依賴於聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。

傳統的Taq估計合成1000bp大概需要1分鍾、較新的Tbr（來自於嗜熱菌Thermusbrockianus）約40秒、商業公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。有修正功能的則會比較慢。

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實例

優化聚合酶鏈式反應:

在實踐中，聚合酶鏈式反應可以因各種原因而失敗，部分原因是由於其對於污染的敏感性，導致擴增錯誤的DNA產物。正因為如此，人們已經開發了一些技術和步驟來優化聚合酶鏈式反應條件。將聚合酶鏈式反應前的混合物與潛在DNA污染物分開的實驗室方案和流程解決了外源DNA的污染問題。

這通常包括從用於分析的區域分理出聚合酶鏈式反應的設定區域或者說聚合酶鏈式反應產物的純化，一次性塑料製品的使用，及對反應裝置之間的工作檯面徹底清潔。引物的設計技術在改善聚合酶鏈式反應產物產率和避免雜產物的形成是很重要的。

替代緩沖成分和聚合酶的使用有助於較長或存在其他問題的DNA區域的擴增。在緩沖體系中加入試劑，如甲醯胺，或會增加聚合酶鏈式反應的特異性和產量。可以利用計算機模擬理論聚合酶鏈式反應結果（電子聚合酶鏈式反應），以協助在引物設計。

⑵ RNA-seq中的基因表達量計算和表達差異分析

原文鏈接： RNA-seq中的基因表達量計算和表達差異分析-生物知識學習 (biotechknowledgestudy.com)

差異分析的步驟：

1）比對；

2） read count計算；

3） read count的歸一化；

4）差異表達分析；

背景知識：

1）比對：

普通比對： BWA，SOAP

開大GAP比對：Tophat（Bowtie2）；

2） Read count(多重比對的問題）：

丟棄

平均分配

利用Unique region估計並重新分配

表達量計算的本質

目標基因表達量相對參照系表達量的數值。

參照的本質：

（ 1）假設樣本間參照的信號值應該是相同的；

（ 2）將樣本間參照的觀測值校正到同一水平；

（ 3）從參照的數值，校正並推算出其他觀測量的值。

例如：Qpcr:目標基因表達量（循環數）相對看家基因表達量（循環數）；RNA-seq:目標基因的表達量（測序reads數），相對樣本RNA總表達量（總測序量的reads數），這是最常用的標准。

歸一化的原因及處理原則：

1）基因長度

2）測序量

3）樣本特異性（例如，細胞mRNA總量，污染等）前兩者使用普通的RPKM演算法就可以良好解決，關鍵是第三個問題，涉及到不同的演算法處理。

RNA-Seq歸一化演算法的意義：

基因表達量歸一化：在高通量測序過程中，樣品間在數據總量、基因長度、基因數目、高表達基因分布甚至同一個基因的不同轉錄本分布上存在差別。因此不能直接比較表達量，必須將數據進行歸一化處理。

RNA-seq差異表達分析的一般原則

1）不同樣品的基因總表達量相似

2）上調差異表達與下調差異表達整體數量相似（上下調差異平衡）

3）在兩組樣品中不受處理效應影響的基因， 表達量應該是相近的（差異不顯著）。

4）看家基因可作為表達量評價依據（ 待定）

不同的演算法比較：

以什麼數值來衡量表達量：RPKM、FPKM、TPM

以什麼作為參照標准：TMM（edgeR軟體）、De seq矯正

RPKM：是Reads Per Kilobase per Million mapped reads的縮寫，代表每百萬reads中來自於某基因每千鹼基長度的reads數。

本質：1）以reads數為計算單位；

2）對基因長度（基因間的比較）和總數據量（樣本間的比較）做矯正；

1）由於可變剪切，同一基因有效轉錄區域長度未必相同（這個一般情況下可以不考慮，了解一下：Cufflinks軟體考慮了這個問題）優化策略：外顯子或轉錄本水平的表達量分析。

2） 使用reads數計算基因表達量有輕微誤差（這里暫不展開，主要了解一下定義）優化策略：FPKM或 TPM

3） mRNA的總量未必相等。

RPKM的優化：FPKm

F = Fragment，即測序片段數量。這些片段都是從完整的cDNA打碎而來的；

本質：以文庫中的片段數量為計算單位在Paired-end測序中，一個fragment就是兩條PE reads構成的片段。由於是PE比對，理論上比SE比對更可靠。

T = Transcripts

本質：以轉錄本的條數為計算單位。使用轉錄本的條數（或者說：轉錄本的測序深度），代替reads數，在一定條件下定量更准，尤其樣本間表達基因總數差異很大的時候（例如，對照樣本有1萬個基因表達，另外處理組僅有4000個基因表達）。

mRNA總量未必相等

mRNA總量不等——細胞本身不同

例如：活躍組織vs休眠的組織；癌細胞vs正常細胞

mRNA總量不等——污染

例如：核糖體污染外源RNA污染

解決方法——不同演算法比較

其中歸一化演算法介紹：

1）Total Count（TC）：總reads數矯正

2）Upper Quartile（UQ）：上四分之一分位數（總reads）

矯正

3）Median（Med）；中位數（總reads數）矯正

4）Quantile (Q)：基因晶元軟體limma中的校正演算法；

5）RPKM：總reads數，但引入了基因長度

6）幾何平均數：Deseq軟體中的演算法；

7）TMM：edgeR軟體中的演算法；

8）RPKM

邏輯1：不同位置數值的穩定性不同

四分位數quartile:將數據按從小到大排列，並分成四等分，這樣得到3個分割點，第一個分割點叫做lowerquartile，第二個叫Media，第三個叫Upper quartile

很顯然，極大值具有極大不穩定性，而且可能會顯著影

響總體之和（假設，我們之中有個馬雲，我們的總收入

有什麼變化？）

所以，Upper quartile和Median的數值，比總表達量之

和更加穩定，更適合作為參照。

邏輯2：表達量居中的基因的表達量值，其數值應該是相似的。

DESeq與edgeR，默認情況下都使用這一的邏輯校正。（DESeq and edgeR Bioconctor packages）

Deseq：異常高表達的基因，會顯著影響細胞中的總mRNA的數量。類似的，如果樣本中受到不同程度的外源RNA，如病毒、真菌等的污染，也會顯著影響樣本總mRNA數，導致RPMK值的誤差。對於這樣的問題，Deseq嘗試對數據進行矯正（矯正因子），使表達量處於中間位置的基因表達量應該是基本相同的（即使用表達量處於中間的基因表達量值作為參照，而減少高表達基因的作用）。

Deseq： 校正因子=樣本表達中位數/所有樣本表達量中位數：回答了一個關鍵的問題：Deseq不同差異比較組間，計算得到的表達量值不同。因

為樣本在變化，「所有樣本表達量的中位數」也在變動。RPKM：總表達量為參照

Deseq：中位數為參照

TMM（edgeR）：與Deseq類似，在去除高表達基因和差異最大的基因後，TMM也是要找到一個加權系數，使剩餘的基因在被矯正後差異倍數可能小。TMM的加權系數是基於兩兩樣本比較後推算獲得的（也就是兩組樣本的比較，將產生與這次比較相關的加權系數）。然後將所有基因除以這個加權系數，從而保證大部分表達量居中的基因表達量最相似。

不同RNA-seq表達量歸一化演算法的區別

Deseq類的校正演算法：理論上更加穩定；但不同批次的比較會得到不同的表達量值，不利於進行多處理組/批次數據的統一分析（例如，趨勢分析、共表達分析）校正會掩蓋一些問題（例如：樣本污染）

RPKM類的演算法： 容易受異常高表達基因、外源污染等的干擾；但也更容易從結果的異常中，發現潛在問題；得到的表達量值是恆定的，多處理組/批次的數據可以合並分析。折中的方法：使用RPKM類的演算法，但需要人工檢查數據是否

異常。備註： Deseq軟體也可以關閉校正的功能。

實際經驗總結

總之：從多方面考慮，RPKM類演算法，如果合理使用，依然是最優的。具體問題具體分析：在遇到問題的時候，找到問題的來源，從而給出解決方案（沒有完美的流程，只有最佳解決方案）