細胞培養技術pdf

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❷ 細胞培養技術有什麼作用

細胞培養技術是細胞工程的基礎技術。所謂細胞培養，就是將生物有機體的某一部分組織取出一小塊進行培養，使之生長、分裂的技術。

在體外細胞培養中，供給離開整體的動植物細胞所需營養的是培養基，培養基中除了含有豐富的營養物質外，一般還含有刺激細胞生長和發育的一些微量物質。培養基一般有固態和液態兩種，它必須經滅菌處理後才可以使用。此外，溫度、光照、振盪頻率等也都是影響培養的重要條件。

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❹ 細胞培養技術都有哪些應用

細胞培養細胞培養技術也叫細胞克隆技術，在生物學中的正規名詞為細胞培養技術。不論對於整個生物工程技術，還是其中之一的生物克隆技術來說，細胞培養都是一個必不可少的過程，細胞培養本身就是細胞的大規模克隆。細胞培養技術可以由一個細胞經過大量培養成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞，這是克隆技術必不可少的環節，而且細胞培養本身就是細胞的克隆。通過細胞培養得到大量的細胞或其代謝產物。因為生物產品都是從細胞得來，所以可以說細胞培養技術是生物技術中最核心、最基礎的技術。 細胞培養技術的研究應用 1. 直接觀察活細胞的形態結構和生命活動。用於細胞學、遺傳學、免疫學、實驗醫學和腫瘤學等多種學科研究. 2. 直接觀察細胞的變化可便於攝影。 3. 研究細胞種類如低等到高等到人類、胚胎到成體、正常組織到腫瘤。 4. 便於使用各種技術：相差、熒光、電鏡、組化、同位素標記等方法觀察和研究細胞狀況。 5. 是分子生物學和基因工程學的研究對象，也是其主要的組成部分。 6. 易於施用物理、化學生物的實驗研究。 7. 易於提供大量生物性狀相似的實驗對象,耗資少比較經濟。 8. 成為生物製品單克隆抗體生產和基因工程等的材料來源。 細胞貼附在支持物表面生長，只依賴貼附才能生長的細胞叫做貼附型細胞(Anchorrage-dependent cells)這種現象與細胞分化有關。

❺ 什麼是細胞培養

美麗的神話《白蛇傳》里，有這么一段感人的情節：白娘娘為了救活被嚇死的丈夫許仙，闖上終南山，和守山的仙童們大戰一場，終於奪下了能起死回生的靈芝仙草，救活了許仙。這個故事又叫《盜仙草》，可說是家喻戶曉。

現代生物學家發現，「靈芝仙草」並非神話虛構，而是確實存在的一種真菌。它有明顯的抗腫瘤作用，所以，說它能「起死回生」也確有道理。遺憾的是，也正如神話中所傳說的那樣，靈芝只生長在少數地區的深山老林里，產量極低，用來治病救人遠遠不敷應用。

細胞工程的出現，從根本上改變了這一局面。靈芝大量用於治病救人已經變成了現實。當然，那不是原來意義上的靈芝，而是靈芝細胞培養的產物。科學家們將野生的靈芝搗碎後，放在特定的培養基中，控制好溫度、光照等條件，靈芝細胞就能迅速繁殖，產生一代又一代新的靈芝細胞。要不了多少天，就可以收獲到數百倍的新生靈芝細胞。除了少數細胞留下來投入到又一輪細胞培養之外，大多數收獲物被用來提取葯用有效成分——靈芝多糖。靈芝多糖神奇的抗腫瘤作用，已經為大量的臨床實踐所證實。它的生產和應用正在迅速推廣之中。

人參，被稱為「葯中之王」，能大補元氣，益壽延年。它的強身滋補作用和對多種疾病的治療作用已經為越來越多的人所認識。然而人參的生產有一個很大的缺陷，那就是栽培期過長。從播種到收獲，至少要五年時間。面對著社會對人參的大量需求，細胞工程又出來大顯神通了。從70年代起，人參的細胞培養在日本、台灣等地相繼獲得成功。我國吉林省的科技人員也攻克了這一難關。

人參細胞培養的周期是25天左右。在周期結束時，細胞培養物中，人參的主要葯理成分——人參皂苷的含量可達6％左右。而一棵栽培了6年的人參，人參皂苷的含量不過是4?5％左右。兩相對照，孰優孰劣就很明顯了。人參細胞培養還具有不受天災、病蟲害的影響，可連續進行等優點，這就更不是人參栽培所能比擬的了。

細胞培養，從原理上來說並不復雜，所需設備也比較簡單，但它仍是一門很精巧的技術。比較關鍵的是確定培養基的配方，特別是針對不同培養物，使用不同種類、不同數量的生長激素。另外，培養的物理條件也很重要。諸如溫度、光照、振盪頻率等，都需要精心研究，仔細掌握。拿光照來說，人參細胞在白光下生長最快，藍光、綠光下就要慢一些，紅光下生長最慢，幾乎和在暗室中生長一樣。而有些植物的細胞對光照的反應卻正好相反。

細胞培養並非局限於植物細胞，動物細胞培養也有它寬廣的天地。要進行動物細胞融合、細胞核移植和DNA重組，動物細胞培養技術是必要的准備。另外，它還被用來生產某些珍貴葯品，用來檢測對人和動物致癌、致畸、致病的有毒物質。至於通過細胞培養來生產豬肉、牛肉、雞肉，目前還僅僅是設想。這樣做在技術上是完全可行的，有待解決的是經濟效益問題。

醫學專家們已經完成了一件驚人之舉。那就是，取下人體的一些皮膚細胞進行培養，數十天後就得到一塊較大面積的新皮。這塊新皮可以移植到大面積的創口上。這對於燒傷病人來說是一個福音。因為傳統的做法是從病人身體其他部位切取一塊健康皮膚來移植到創口上，可以想像，那是多麼痛苦！

❻ 如何進行細胞培養

細胞培養（cell culture）是指在體外模擬體內環境（無菌、適宜溫度、酸鹼度和一定營養條件等），使之生存、生長、繁殖並維持主要結構和功能的一種方法。細胞培養也叫細胞克隆技術，在生物學中的正規名詞為細胞培養技術。不論對於整個生物工程技術，還是其中之一的生物克隆技術來說，細胞培養都是一個必不可少的過程，細胞培養本身就是細胞的大規模克隆。細胞培養技術可以由一個細胞經過大量培養成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞，這是克隆技術必不可少的環節，而且細胞培養本身就是細胞的克隆。細胞培養技術是細胞生物學研究方法中重要和常用技術，通過細胞培養既可以獲得大量細胞，又可以藉此研究細胞的信號轉導、細胞的合成代謝、細胞的生長增殖等。

❼ 什麼是細胞培養技術

細胞培養技術是指在體外模擬體內環境（無菌、適宜溫度、酸鹼度和一定營養條件等），使之生存、生長、繁殖並維持主要結構和功能的一種方法。細胞培養技術指的是細胞在體外條件下的生長，在培養的過程中，培養物是單個細胞或細胞群。細胞在培養時都要生活在人工環境中，由於環境的改變，細胞的移動或受一些其他因素的影響，培養時間加長，傳代導致細胞出現單一化型。
細胞培養技術也叫細胞克隆技術，在生物學中的正規名詞為細胞培養技術。不論對於整個生物工程技術，還是其中之一的生物克隆技術來說，細胞培養都是一個必不可少的過程，細胞培養本身就是細胞的大規模克隆。細胞培養技術可以由一個細胞經過大量培養成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞，這是克隆技術必不可少的環節，而且細胞培養本身就是細胞的克隆。細胞培養技術是細胞生物學研究方法中重要和常用技術，通過細胞培養既可以獲得大量細胞，又可以藉此研究細胞的信號轉導、細胞的合成代謝、細胞的生長增殖等。
一、動物細胞培養
在所有的細胞離體培養中，最困難的是動物細胞培養。下面是它所需要的特殊條件。
⑴血清：動物細胞離體培養常常需要血清。最常用的是小牛血清。血清提供生長必需因子，如激素、微量元素、礦物質和脂肪。在這里，血清等於是動物細胞離體培養的天然營養液。
⑵支持物：大多數動物細胞有貼壁生長的習慣。離體培養常用玻璃，塑料等作為支持物。
⑶氣體交換：二氧化碳和氧氣的比例要在細胞培養過程中不斷進行調節，不斷維持所需要的氣體條件。
二、植物細胞培養
⑴光照：離體培養的植物細胞對光照條件不甚嚴格，因為細胞生長所需要的物質主要是靠培養基供給的。但光照不但與光合作用有關，而且與細胞分化有關，例如光周期可對性細胞分化和開花調控作用，所以以獲得植株為目的的早期植物細胞培養過程中，光照條件特別重要。以植物細胞離體培養方式獲得重要物質，如葯物的過程，植物細胞大多是在反應器中懸浮培養。
⑵激素：植物細胞的分裂和生長特別需要植物激素的調節，促進生長的生長素和促進細胞分裂的分裂素是最基本的激素。植物細胞的分裂，生長，分化和個體生長周期都有相應的激素參與調節。和動物細胞相比，植物細胞離體培養對激素要求的原理已經了解，其應用技術也已相當成熟，已經有一套能使用的培養液。同時解決了植物細胞對水、營養物、激素、滲透壓、酸鹼度、微量元素等的需求。
三、微生物細胞培養
微生物多為單細胞生物，野生生存條件比較簡單。所以微生物人工培養的條件比動植物細胞簡單得多。其中厭氧微生物培養比好氧微生物復雜，因為嚴格厭氧需要維持二氧化碳等非氧的惰性氣體濃度，而好氧微生物則只需要通過不斷攪拌提供無菌氧氣。微生物對培養條件要求不如動植物細胞那樣苛刻，玉米漿、蛋白腖、麥芽汁、酵母膏等成為良好的微生物天然培養基。對於一些特殊微生物的營養條件要求，可以在這些天然培養基的基礎上額外添加。

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❾ 細胞培養的具體步驟和要求以及注意事項

一、細胞復甦

將凍存細胞從液氮中取出後，在37℃水浴鍋內不斷搖動促進其融化。移人15ml離心管中，加入10ml預熱的DMEM完全培養基，輕輕吹勻，離心，2000rpmX2min，棄上清液。

加入10ml DMEM培養基清洗，棄上清液。加入10ml DMEM完全培養基，輕輕吹打，接種於10cm盤中，在含5%CO2的細胞培養箱中培養。

二、細胞傳代

細胞密度達到80%~90%時．去培養基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人細胞培養箱3min。加人1ml DMEM完全培養基終止胰酶消化，轉移至15ml離心管。

加入10ml PBS清洗細胞培養盤，轉移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。再加入10ml PBS（經高壓滅菌，保存於40C），吹勻，吸取10微升進行計數，按照1×106/盤接種，在含5%CO2的細胞培養箱繼續培養。

三、細胞凍存

細胞密度達到80%～90%時，去培養基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人細胞培養箱3min。加入lmlDMEM完全培養基終止胰酶消化，轉移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細胞培養盤，轉移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。

加入lml凍存液（90%血清，10%DMSO），放入凍存盒內（盒內有異丙醇，以保證溫度降低的速度），立即放入一80℃冰箱內，過夜，第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放人液氮，可以保存三個月。

凍存液的配製：70%的完全培養基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。

注意事項

（1）進入細胞間開始細胞培養時，必須嚴格按照下列步驟操作：

①確定所有的細胞操作用的溶液和耗材都已經消毒並檢測沒有問題，不確定的溶液和耗材請勿使用，除非特殊情況，不要借用別人的溶液。

②確定衣服的袖口已經捲起或者白大褂的袖口已經扎緊。

③確定酒精燈內的酒精量，需要的話及時進行補充。

④確定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。為了方便單手開啟瓶蓋，實驗開始前可以把所有瓶蓋旋松。

⑤盡量不要直接傾倒溶液，除非瓶口沒有被燒壞。如果傾倒失敗，溶液粘在瓶口，請用噴過75%酒精的紙巾仔細清潔瓶口周圍（不要接觸到瓶口）後在火焰上簡單燒灼。

⑥操作時如果不能肯定所用的耗材是潔凈的，必須及時更換。

⑦實驗完畢及時收拾，保持工作區域清潔整齊，最後用75%酒精清潔檯面。

（2）細胞污染的預防

①實驗用品防止污染。細胞培養所用試劑、耗材、器材的清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌要仔細，並在無菌實驗檢測陰性後才能使用。操作室及剩餘的無菌器材要定期清潔、消毒、滅菌。

②操作過程防止污染。

③穿著容易起靜電或吸附灰塵的衣物必須更換為白大褂後才能進入細胞間。

④實驗開始前需要確定戴的手套沒有問題，只要接觸過生物安全櫃之外的物品，必須及時對手套進行消毒。

⑤進入細胞培養間後關好門，坐下來盡量少走動以免影響生物安全櫃的風簾。工作開始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶蓋。事先要嚴格檢查所用的器材、溶液和細胞，不要把污染品或未經消毒的物品帶入無菌室內，更不能隨便使用，以免造成大規模污染。

⑥細胞操作時動作要輕，必須在火焰周圍無菌區內打開瓶口，並將瓶口放在火焰周圍簡單轉動燒灼，注意不要讓火焰把塑料瓶口燒化。

⑦實驗操作時生物安全櫃的隔板要盡可能放低，盡量減少談話，打噴嚏或咳嗽時絕對不能對著工作區，以免造成不必要的污染。

⑧瓶蓋應當倒放在遠離自己的地方，以避免瓶蓋被誤操作所污染。

⑨不要從敞開的容器口上方經過，以避免衣服上掉落不明物體對細胞的污染。

⑩實驗操作時要注意及時更換巴斯德吸管、移液槍槍頭和移液管，切勿一根管子做到底。一旦發現接觸了非潔凈或者無法確定潔凈的物品必須直接丟棄。實驗完畢應及時收拾，保持實驗室清潔整齊，最後用75%酒精清潔檯面。

（3）防止細胞交叉污染

①在進行多種細胞培養操作時，所用器具要嚴格區分，最好作上標記便於辨別。按順序進行操作，一次只處理一種細胞，多種細胞多種操作一起進行時易發生t昆亂。

②在進行換液或傳代操作時，粘有細胞的移液槍頭和移液管不要觸及試劑瓶瓶口，以免把細胞帶到培養基中污染其他細胞。

③所有細胞一旦購置，或從別處引入，或自己建立，必須及時保種凍存，一旦發生污染可重新復甦細胞，繼續培養。

(9)細胞培養技術pdf擴展閱讀：

細胞培養（cell culture）是指在體外模擬體內環境（無菌、適宜溫度、酸鹼度和一定營養條件等），使之生存、生長、繁殖並維持主要結構和功能的一種方法。細胞培養也叫細胞克隆技術，在生物學中的正規名詞為細胞培養技術。

不論對於整個生物工程技術，還是其中之一的生物克隆技術來說，細胞培養都是一個必不可少的過程，細胞培養本身就是細胞的大規模克隆。細胞培養技術可以由一個細胞經過大量培養成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞，這是克隆技術必不可少的環節，而且細胞培養本身就是細胞的克隆。

細胞培養技術是細胞生物學研究方法中重要和常用技術，通過細胞培養既可以獲得大量細胞，又可以藉此研究細胞的信號轉導、細胞的合成代謝、細胞的生長增殖等。

❿ 細胞培養的實驗報告

細胞培養

1.實驗目的

初步掌握哺乳動物細胞的原代培養與傳代培養的基本操作過程，為生物工程在醫學上的應用打下基礎。

2.實驗原理

從生物體中取出某種組織或細胞，模擬體內生理條件，在人工培養條件下使其生存、生長、繁殖或傳代，這一過程稱為細胞培養。細胞培養技術的最大優點是使我們得以直接觀察活細胞，並在有控制的環境條件下進行實驗，避免了體內實驗時的許多復雜因素，還可以與體內實驗互為補充，可同時提供大量生物性狀相同的細胞作為研究對象，耗費少，比較經濟，因此成為生物學研究的重要手段。近年來，在體細胞遺傳、分化、胚胎發生、腫瘤發生、免疫學、細胞工程、放射生物學以及老年學等一系列的研究領域中得到廣泛的應用，並取得了豐碩的成果。

細胞培養可分為原代培養和傳代(繼代)培養。直接從體內獲取的組織細胞進行首次培養為原代培養；當原代培養的細胞增殖達到一定密度後，則需要做再培養，即將培養的細胞分散後，從一個容器以1：2或其他比率轉移到另一個或幾個容器中擴大培養，為傳代培養，傳代培養的累積次數就是細胞的代數。

細胞培養是一種程序復雜、要求條件多而嚴格的實驗性工作。所有離體細胞的生長都受溫度、滲透壓、pH值、無機鹽影響，消毒、配液等均有嚴格的規范和要求，特別是無菌操作是細胞培養成敗的關鍵。

3.實驗用品

3.1 材料和標本 乳兔、HeLa細胞(人宮頸癌細胞)

3.2 器材和儀器 手術器械、平皿、培養瓶、吸管、離心管(滅菌後備用)、酒精燈、燒杯、超凈工作台、二氧化碳培養箱、倒置顯微鏡。

2.3 試劑 含有5％小牛血清的MEM培養液、0.01mol／L PBS，0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液、75％乙醇。

4.實驗方法

4.1 原代細胞培養

4.1.1 原理

細胞培養(Cell culture)是模擬機體內生理條件，將細胞從機體中取出，在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代，進行細胞生命過程、細胞癌變、細胞工程等問題的研究。近年來，廣泛地應用於分子生物學、遺傳學、免疫學、腫瘤學、細胞工程等領域，發展成一種重要生物技術，並取得顯著成就。由體內直接取出組織或細胞進行培養叫原代培養。原代培養細胞離體時間短，性狀與體內相似，適用於研究。一般說來，幼稚狀態的組織和細胞，如：動物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進行原代培養。

4.1.2 操作

①．取材

用頸椎脫位法使乳兔迅速死亡。然後，把整個動物浸入盛有75％乙醇的燒杯中數秒鍾消毒，取出後放在大平皿中攜入超凈台。用消過毒的剪刀剪開用碘酒和乙醇再次消毒後的皮膚，剖腹取出肝臟或腎臟。置於無菌平皿中。

②．切割

用滅菌的PBS液將取出的臟器清洗三次，然後用眼科手術剪刀仔細將組織反復剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用PBS清洗，洗到組織塊發白為止。移入無菌離心管中，靜置數分鍾，使組織塊自然沉澱到管底，棄去上清。

③．消化、接種培養

吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1ml，加入離心管中，與組織塊混勻後，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分鍾，每隔幾分鍾搖動一下試管，使組織與消化液充分接觸，靜止，吸去上清，向離心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培養基，用吸管吹打混勻，移入二個培養瓶中，置於二氧化碳培養箱中培養。

4.1.3 結果

細胞接種後一般幾小時內就能貼壁，並開始生長，如接種的細胞密度適宜，5天到一周即可形成單層。

4.2 傳代細胞培養

4.2.1 原理

體外培養的原代細胞或細胞株要在體外持續地培養就必須傳代，以便獲得穩定的細胞株或得到大量的同種細胞，並維持細胞種的延續。培養的細胞形成單層匯合以後，由於密度過大生存空間不足而引起營養枯竭，將培養的細胞分散，從容器中取出，以1:2或l:3以上的比率轉移到另外的容器中進行培養，即為傳代培養。

細胞「一代」指從細胞接種到分離再培養的一段期間，與細胞世代或倍增不同。在一代中，細胞培增3～6次。細胞傳代後，一般經過三個階段：游離期、指數增生期和停止期。

常用細胞分裂指數表示細胞增殖的旺盛程度，即細胞群的分裂相數／100個細胞。一般細胞分裂指數介於0.2％～0.5％，腫瘤細胞可達3～5％。細胞接種2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好時期，稱指數增生期(對數生長期)，適宜進行各種試驗。

4.2.2 操作

①．將長成單層的原代培養細胞或HeLa細胞從二氧化碳培養箱中取出，在超凈工作台中倒掉瓶內的培養液，加入少許消化液。(以液面蓋住細胞為宜)，靜置5～10分鍾。

②.在倒置鏡下觀察被消化的細胞，如果細胞變園，相互之間不再連接成片，這時應立即

在超凈台中將消化液倒掉，加入3～5ml新鮮培養液，吹打，製成細胞懸液。

③．將細胞懸液吸出2ml左右，加到另一個培養瓶中並向每個瓶中分別加3ml左右培養液，蓋好瓶塞，送回二氧化碳培養箱中，繼續進行培養。

4.2.3 結果

一般情況，傳代後的細胞在2小時左右就能附著在培養瓶壁上，2～4天就可在瓶內形成單層，需要再次進行傳代。

4.3 器材及液體的准備和無菌操作的注意事項

4.3.1 器材和液體的准備

細胞培養用的玻璃器材，如：培養瓶、吸管等在清洗干凈以後，裝在鋁盒和鐵筒中，120℃，2小時干烤滅菌後備用；手術器材、瓶塞、配製好的PBS液用滅菌鍋15磅，20分鍾蒸氣滅菌；MEM培養液、小牛血清、消化液用G6濾器負壓抽濾後備用。

4.3.2 無菌操作中的注意事項

在無菌操作中，一定要保持工作區的無菌清潔。為此，在操作前要認真地洗手並用75％乙醇消毒。操作前20～30分鍾起動超凈台吹風。操作時，嚴禁說話，嚴禁用手直接拿無菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血鉗、鑷子等去拿。培養瓶要在超凈台內才能打開瓶塞，打開之前用乙醇將瓶口消毒，打開後和加塞前瓶口都要在酒精燈上燒一下，打開瓶口後的操作全部都要在超凈台內完成。操作完畢後，加上瓶塞，才能拿到超凈台外。使用的吸管在從消毒的鐵筒中取出後要手拿末端，將尖端在火上燒一下，戴上膠皮乳頭，然後再去吸取液體。總之，在整個無菌操作過程中都應該在酒精燈的周圍進行。

5．實驗報告

(1).原代細胞和傳代細胞培養有哪些區別?

(2).總結一下你自己的經驗，怎樣才能既迅速，又保證無菌操作。 細胞培養

1.實驗目的

初步掌握哺乳動物細胞的原代培養與傳代培養的基本操作過程，為生物工程在醫學上的應用打下基礎。

2.實驗原理

從生物體中取出某種組織或細胞，模擬體內生理條件，在人工培養條件下使其生存、生長、繁殖或傳代，這一過程稱為細胞培養。細胞培養技術的最大優點是使我們得以直接觀察活細胞，並在有控制的環境條件下進行實驗，避免了體內實驗時的許多復雜因素，還可以與體內實驗互為補充，可同時提供大量生物性狀相同的細胞作為研究對象，耗費少，比較經濟，因此成為生物學研究的重要手段。近年來，在體細胞遺傳、分化、胚胎發生、腫瘤發生、免疫學、細胞工程、放射生物學以及老年學等一系列的研究領域中得到廣泛的應用，並取得了豐碩的成果。

細胞培養可分為原代培養和傳代(繼代)培養。直接從體內獲取的組織細胞進行首次培養為原代培養；當原代培養的細胞增殖達到一定密度後，則需要做再培養，即將培養的細胞分散後，從一個容器以1：2或其他比率轉移到另一個或幾個容器中擴大培養，為傳代培養，傳代培養的累積次數就是細胞的代數。

細胞培養是一種程序復雜、要求條件多而嚴格的實驗性工作。所有離體細胞的生長都受溫度、滲透壓、pH值、無機鹽影響，消毒、配液等均有嚴格的規范和要求，特別是無菌操作是細胞培養成敗的關鍵。

3.實驗用品

3.1 材料和標本 乳兔、HeLa細胞(人宮頸癌細胞)

3.2 器材和儀器 手術器械、平皿、培養瓶、吸管、離心管(滅菌後備用)、酒精燈、燒杯、超凈工作台、二氧化碳培養箱、倒置顯微鏡。

2.3 試劑 含有5％小牛血清的MEM培養液、0.01mol／L PBS，0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液、75％乙醇。

4.實驗方法

4.1 原代細胞培養

4.1.1 原理

細胞培養(Cell culture)是模擬機體內生理條件，將細胞從機體中取出，在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代，進行細胞生命過程、細胞癌變、細胞工程等問題的研究。近年來，廣泛地應用於分子生物學、遺傳學、免疫學、腫瘤學、細胞工程等領域，發展成一種重要生物技術，並取得顯著成就。由體內直接取出組織或細胞進行培養叫原代培養。原代培養細胞離體時間短，性狀與體內相似，適用於研究。一般說來，幼稚狀態的組織和細胞，如：動物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進行原代培養。

4.1.2 操作

①．取材

用頸椎脫位法使乳兔迅速死亡。然後，把整個動物浸入盛有75％乙醇的燒杯中數秒鍾消毒，取出後放在大平皿中攜入超凈台。用消過毒的剪刀剪開用碘酒和乙醇再次消毒後的皮膚，剖腹取出肝臟或腎臟。置於無菌平皿中。

②．切割

用滅菌的PBS液將取出的臟器清洗三次，然後用眼科手術剪刀仔細將組織反復剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用PBS清洗，洗到組織塊發白為止。移入無菌離心管中，靜置數分鍾，使組織塊自然沉澱到管底，棄去上清。

③．消化、接種培養

吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1ml，加入離心管中，與組織塊混勻後，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分鍾，每隔幾分鍾搖動一下試管，使組織與消化液充分接觸，靜止，吸去上清，向離心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培養基，用吸管吹打混勻，移入二個培養瓶中，置於二氧化碳培養箱中培養。

4.1.3 結果

細胞接種後一般幾小時內就能貼壁，並開始生長，如接種的細胞密度適宜，5天到一周即可形成單層。

4.2 傳代細胞培養

4.2.1 原理

體外培養的原代細胞或細胞株要在體外持續地培養就必須傳代，以便獲得穩定的細胞株或得到大量的同種細胞，並維持細胞種的延續。培養的細胞形成單層匯合以後，由於密度過大生存空間不足而引起營養枯竭，將培養的細胞分散，從容器中取出，以1:2或l:3以上的比率轉移到另外的容器中進行培養，即為傳代培養。

細胞「一代」指從細胞接種到分離再培養的一段期間，與細胞世代或倍增不同。在一代中，細胞培增3～6次。細胞傳代後，一般經過三個階段：游離期、指數增生期和停止期。

常用細胞分裂指數表示細胞增殖的旺盛程度，即細胞群的分裂相數／100個細胞。一般細胞分裂指數介於0.2％～0.5％，腫瘤細胞可達3～5％。細胞接種2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好時期，稱指數增生期(對數生長期)，適宜進行各種試驗。

4.2.2 操作

①．將長成單層的原代培養細胞或HeLa細胞從二氧化碳培養箱中取出，在超凈工作台中倒掉瓶內的培養液，加入少許消化液。(以液面蓋住細胞為宜)，靜置5～10分鍾。

②.在倒置鏡下觀察被消化的細胞，如果細胞變園，相互之間不再連接成片，這時應立即

在超凈台中將消化液倒掉，加入3～5ml新鮮培養液，吹打，製成細胞懸液。

③．將細胞懸液吸出2ml左右，加到另一個培養瓶中並向每個瓶中分別加3ml左右培養液，蓋好瓶塞，送回二氧化碳培養箱中，繼續進行培養。

4.2.3 結果

一般情況，傳代後的細胞在2小時左右就能附著在培養瓶壁上，2～4天就可在瓶內形成單層，需要再次進行傳代。

4.3 器材及液體的准備和無菌操作的注意事項

4.3.1 器材和液體的准備

細胞培養用的玻璃器材，如：培養瓶、吸管等在清洗干凈以後，裝在鋁盒和鐵筒中，120℃，2小時干烤滅菌後備用；手術器材、瓶塞、配製好的PBS液用滅菌鍋15磅，20分鍾蒸氣滅菌；MEM培養液、小牛血清、消化液用G6濾器負壓抽濾後備用。

4.3.2 無菌操作中的注意事項

在無菌操作中，一定要保持工作區的無菌清潔。為此，在操作前要認真地洗手並用75％乙醇消毒。操作前20～30分鍾起動超凈台吹風。操作時，嚴禁說話，嚴禁用手直接拿無菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血鉗、鑷子等去拿。培養瓶要在超凈台內才能打開瓶塞，打開之前用乙醇將瓶口消毒，打開後和加塞前瓶口都要在酒精燈上燒一下，打開瓶口後的操作全部都要在超凈台內完成。操作完畢後，加上瓶塞，才能拿到超凈台外。使用的吸管在從消毒的鐵筒中取出後要手拿末端，將尖端在火上燒一下，戴上膠皮乳頭，然後再去吸取液體。總之，在整個無菌操作過程中都應該在酒精燈的周圍進行。

5．實驗報告

(1).原代細胞和傳代細胞培養有哪些區別?

(2).總結一下你自己的經驗，怎樣才能既迅速，又保證無菌操作。