細胞培養pdf

1. 關於CHO細胞的培養方法

CHO細胞（中國倉鼠卵巢細胞）培養方法（正統法）
CHO細胞（中國倉鼠卵巢細胞）培養方法（正統法）
※准備
��DMEM培養基
��PBS(-)
��Trypsin（0.25％）
��MTX（100μM）
��移液管
��自動移液槍
��廢液缸
※培養基量
25c㎡��‥‥5ml
75c㎡��‥‥10ml
※操作順序
①把培養瓶內的培養基用5ml的移液管轉移到保存用的離心管里.
②用培養液量的1/2的PBS（25ml‥2.5ml）清洗細胞表面（2次）.
③再用培養液量的1/10的（25ml‥0.5ml）的胰酶沖洗細胞表面
④再CO2培養廂里靜置5分鍾.（利用這段時間,准備好15ml的大離心管,並也好標簽做好記號.）
⑤物理方法處理,（敲擊培養瓶兩側）是細胞脫離,再用顯微鏡確認是否完全脫離.
⑥加入等倍量的（25ml‥5ml）培養基,充分沖洗培養瓶內表面,在連同細胞全部轉移到大離心管中.
⑦離心分離（1,000rpm、4℃、10min）.（這段時間准備新的培養瓶,按照9/10的量（25ml‥4.5ml）,加入培養液准備好.加入MTX的同時加入.）：50nMMTX:2.5ulof100uM/final5ml培養液（這期間,要在培養瓶表面寫上細胞培養的諸多條件和細胞的種類等等.）
⑧離心分離後,為了避免沉澱細胞擴散到溶液里,要迅速將上清用吸管吸除.
⑨加入培養液(DMEM+FBS,25ml‥5ml),用移液管充分混勻細胞.
⑩按1/10量,（25ml‥0.5ml）將細胞懸濁液注入新培養瓶中.
��在CO2培養廂中37度條件下培養.培養液總量為5ml
註：使用的移液管為培養專用玻璃移液管,在上面吸口處,塞上棉花經過乾熱滅菌的.乾熱條件：180℃、3小時.
CHO細胞培養：
CHO細胞株置於RPMI1640培養基中,內含10%滅活小牛血清,青黴素100IU/mL,鏈黴素100IU/mL,置於37℃,5%CO2的培養箱（德國Heraeus）中培養.每隔48h換培液,當單層培養細胞匯合以後,用0.25%胰蛋白酶消化,傳代培養.將培養瓶中的CHO細胞按1×105/mL傳代移入培養板中,待進入對數生長期後（約24h）加葯.
這是細胞的供給源:
CHO細胞由中科院上海生物化學和細胞生物學研究所提供.
這是我對此細胞的看法:
1.CHO細胞主要來源於中華倉鼠卵巢細胞.
2.與3T3(鼠纖維細胞)293(HEK)COS(猴腎細胞)HepG2(人肝細胞)C2C12(鼠肌細胞)Hl5(昆蟲)AFT024(鼠基質細胞)一起,是重組DNA的主要載體細胞,常見於基因工程.
3.培養基可有多種選擇,一般用RPMI1640培養基或DMEM培養基.

2. 誰有細胞傳代培養具體的操作步驟和注意事項

懸浮細胞可採用加入等量新鮮培養基後直接吹打分散進行傳代，或用離心法後，加入新培養基後再吹打分散進行傳代

貼壁細胞實驗需准備超凈台噴灑酒精，紫外照射30min。准備好培養瓶/皿，離心管，10%DMEM，0.25%胰酶，D-hanks液等，帶上手套，口罩等，倒去舊培養基，用D-hanks液清洗一遍，去除沉積的死細胞等。

加入2ml 0.25％胰蛋白酶消化液，消化2～3min，倒置顯微鏡下觀察，待細胞單層收縮突起出現空隙時，倒去酶液。加入1～2滴管含有血清的培養液，反復吹打細胞，使其成細胞懸液。

以1：2或1：3進行分裝，補充新鮮培養基，並在培養瓶上做好標記，註明代號、日期，輕輕搖勻，37℃CO2培養箱培養。細胞培養24h後，即可觀察培養液的顏色及細胞的生長情況。

(2)細胞培養pdf擴展閱讀：

注意事項

1、傳代培養時要注意無菌操作並防止細胞之間的交叉污染。所有操作要盡量靠近酒精燈火焰。每次最好只進行一種細胞的操作。每一種細胞使用一套器材。培養用液應嚴格分開。

2、每天觀察細胞形態，掌握好細胞是否健康的標准：健康細胞的形態飽滿，折光性好，生長緻密時即可傳代。

3、如發現細胞有污染跡象，應立即採取措施，一般應棄置污染的細胞，如果必須挽救，可加含有抗生素的BSS或培養基反復清洗，隨後培養基中加入較大量的抗菌素，並經常更換培養基等。

3. 如何進行細胞原代培養

原代培養是指直接從機體取下細胞、組織和器官後立即進行培養。因此，較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養，此時的細胞保持原有細胞的基本性質，如果是正常細胞，仍然保留二倍體數。但實際上，通常把第一代至第十代以內的培養細胞統稱為原代細胞培養。最常用的原代培養有組織塊培養和分散細胞培養。
分散細胞培養大致步驟為：將動物組織從機體中取出離散成單個細胞（常用胰蛋白酶），置合適的培養基中培養，使細胞 得以生存、生長和繁殖（注意整個過程無菌）。
組織塊培養是將剪碎的組織塊直接移植在培養瓶壁上，加入培養基後進行培養。

4. 細胞模型的建立及培養方法有哪些

輕輕吹打,可先離心（1000rpm. 2,如要高濃度或需更換新培養基,新鮮培養基重懸沉澱,置培養瓶內輕輕搖晃: 1,吸的越干凈越好,(根據配製強度經驗),鏡下見細胞收縮變圓或少數脫落後. 一,然後收集離心（1000rpm 5min左右）,50ml培養瓶加入消化液約0；也可復甦當時離心（1000rpm 5min左右）後,以免中和後加入的消化液,輕輕振動瓶底使細胞全部脫落.在無菌台內將完全培養基加入培養瓶內,然後繼續進行傳代、傳代培養首先進行細胞復甦,使細胞基本成單個懸浮,然後用無菌吸管從凍存管內取出細胞細胞培養首先分為原代培養和傳代培養、凍存,取出凍存的細胞迅速放入後交細胞面浸至水面以下不斷搖動至融化,晃動使消化液鋪均勻置37度培養箱約2分鍾,24h後換液.貼壁細胞.6ml,加入完全培養基繼續培養、原代培養需要從組織中消化,去除血清和死細胞,輕輕吹勻後.懸浮細胞,加入完全培養基後繼續培養或實驗: 對於貼壁細胞應先吸(倒)盡培養基,加入2-3ml完全培養基後,適時換液,按此比例進行消化.PBS清洗2-3次,使強度減弱,使細胞均勻後置培養箱內培養: 1,5min左右）後加入完全培養基,完全培養基重懸培養. 2.先將水溫鍋調至37-38度.應遵守慢凍快融的原則；二、純化出單細胞、分離. 細胞傳代: 一般傳代可直接將細胞原液分置其它培養瓶內,分置其它培養瓶內加入完全培養基繼續培養

5. 求《動物細胞培養基本技術和特殊應用指南原書第七版》全文免費下載百度網盤資源,謝謝~

《動物細胞培養基本技術和特殊應用指南原書第七版》網路網盤pdf最新全集下載:
鏈接：https://pan..com/s/1AAO2105xBf5HZ3WAvinY7Q

6. 細胞培養一般方法有哪些

細胞培養首先分為原代培養和傳代培養.
一、原代培養需要從組織中消化、分離、純化出單細胞,然後繼續進行傳代、凍存；
二、傳代培養首先進行細胞復甦:
1.應遵守慢凍快融的原則.先將水溫鍋調至37-38度,取出凍存的細胞迅速放入後交細胞面浸至水面以下不斷搖動至融化.
2.在無菌台內將完全培養基加入培養瓶內,然後用無菌吸管從凍存管內取出細胞,置培養瓶內輕輕搖晃,使細胞均勻後置培養箱內培養,24h後換液；也可復甦當時離心（1000rpm 5min左右）後,完全培養基重懸培養,適時換液.
細胞傳代:
1.貼壁細胞:
對於貼壁細胞應先吸(倒)盡培養基,吸的越干凈越好,以免中和後加入的消化液,使強度減弱.PBS清洗2-3次,去除血清和死細胞,50ml培養瓶加入消化液約0.6ml,按此比例進行消化,(根據配製強度經驗),晃動使消化液鋪均勻置37度培養箱約2分鍾,鏡下見細胞收縮變圓或少數脫落後,輕輕振動瓶底使細胞全部脫落,加入2-3ml完全培養基後,輕輕吹打,使細胞基本成單個懸浮,然後收集離心（1000rpm 5min左右）,新鮮培養基重懸沉澱,加入完全培養基後繼續培養或實驗.
2.懸浮細胞:
一般傳代可直接將細胞原液分置其它培養瓶內,加入完全培養基繼續培養,如要高濃度或需更換新培養基,可先離心（1000rpm,5min左右）後加入完全培養基,輕輕吹勻後,分置其它培養瓶內加入完全培養基繼續培養.

7. 傳代細胞的培養步驟

1、附著型胞(adherentcell)

（1）吸掉舊培養液。

（2）用D-PBS洗滌細胞一至二次。

（3）加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37℃作用數分鍾，於倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA作用後，加入適量含血清之新鮮培養基終止trypsin作用，離心後再吸掉上清液。

（4）輕拍培養瓶使細胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養基，以吸管上下吸放數次以打散細胞團塊，混和均勻後，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，以正常培養條件培養。

2、懸浮型細胞(suspensioncell)

（1）吸出細胞培養液，放入離心管中，離心1000rpm5分鍾。

（2）吸掉上清液，加入適量之新鮮培養基，混和均勻後，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，以正常培養條件培養。

3、融合瘤(hybridoma)

有些hybridomacell需培養三天以上才會產生抗體，若是更換培養基，則可能會失去抗體。因此繼代培養不需離心後更換培養基，直接添加新鮮培養基稀釋細胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養瓶中。

(7)細胞培養pdf擴展閱讀：

傳代方法：

1、懸浮生長細胞傳代

多採用離心法傳代。1000轉/分,20-30秒後去上清。沉澱細胞加新培養液後再混勻傳代。亦有直接傳代 法，即懸浮細胞沉澱在瓶壁時，將上清培養液去除1/2-1/3，然後用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代.

2、半懸浮生長細胞傳代（Hela細胞）

此類細胞部分呈現貼壁生長現象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。

3、貼壁生長細胞傳代

採用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。

8. 《細胞實驗指南上冊+下冊》pdf下載在線閱讀全文，求百度網盤雲資源

《細胞實驗指南上冊+下冊》網路網盤pdf最新全集下載:
鏈接: https://pan..com/s/14hMl7_8BjZUV1b0Z84mJnQ

9. 細胞懸浮培養技術

植物細胞懸浮培養 實驗方法
1.用鑷子夾取出生長旺盛的松軟愈傷組織，放入三角瓶中並輕輕夾碎。每100ml三角瓶含滅過菌MS培養基10~15ml，每瓶接種1~1.5g愈傷組織，以保證最初培養物中有足夠量的細胞。
2.將已接種的三角置於旋轉式搖床上。在100r/min，25~28℃條件下，進行振盪培養。
3.經6~10天培養後，若細胞明顯增殖，可向培養瓶中加新鮮培養基10ml，必要時，可用大口移液管將培養物分裝成兩瓶，繼續培養。（若細胞無明顯增殖，可能是起始材料不適當，應考慮用旺盛增殖期的愈傷組織重新接種）。可進行第一次繼代培養。
4.縣浮培養物的過濾：按「3」法繼代培養幾代後，培養液中應主要由單細胞和小細胞團（不多於20個細胞）組成。若仍含有效大的細胞團，可用適當孔徑的金屬網篩過濾，再將過濾後的縣浮細胞繼續培養。
5.細胞計算。取一定體積的細胞縣液，加入2倍體積的8%的三氧化鉻（CrO3），置700C水浴處理15min。冷卻後，用移液管重復吹打細胞懸液，以使細胞充分分散，混勻後，取一滴縣液置入血細胞計數板上計數。
6.製作細胞生長曲線：為了解縣浮培養細胞的生長動態，可用以下方法繪制生長曲線圖：
（1）鮮重法（fresh weigh method）
在轉代培養的不同時間，取一定體積的懸浮細胞培養物，離心收集後，稱量細胞的鮮重，以鮮重為縱座標，培養時間為橫座標，繪制鮮重增長曲線。
（2）乾重法（dry weigh method ）
可在稱量鮮重之後，將細胞進行曲烘乾，再稱量乾重。以乾重為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制細胞乾重生長曲線。
上述兩種方法均需每隔2天取樣一次，共取7次，每個樣品重復三次，整個實驗進行期間不再往培養瓶中換入新鮮培養液。
7.細胞活力的檢查。對於初學者，往往需要檢測活細胞的比率。可在培養的不同階段，吸取一滴細胞縣液，放在載玻片上，滴一滴0。1%的酚藏花紅溶液（用培養基配製）染色，在顯微鏡下觀察。幾活細胞均不著色，而死細胞則很快被染成紅色。也可用0。1%熒光雙醋酸酯溶液染色，凡活細胞將在紫外光誘發下顯示藍絕色熒光，有經驗的操作者，則可根據細胞形態，胞質環流判別細胞的死活。
8.細胞再生能力的鑒定：為了解懸浮培養細胞是否仍具有再生能力，可將培養細胞轉移到瓊脂固化的培養基上，使基再形成愈傷組織，進而在分化培養基上，誘導植株的分化。

10. 細胞培養的具體步驟和要求以及注意事項

一、細胞復甦

將凍存細胞從液氮中取出後，在37℃水浴鍋內不斷搖動促進其融化。移人15ml離心管中，加入10ml預熱的DMEM完全培養基，輕輕吹勻，離心，2000rpmX2min，棄上清液。

加入10ml DMEM培養基清洗，棄上清液。加入10ml DMEM完全培養基，輕輕吹打，接種於10cm盤中，在含5%CO2的細胞培養箱中培養。

二、細胞傳代

細胞密度達到80%~90%時．去培養基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人細胞培養箱3min。加人1ml DMEM完全培養基終止胰酶消化，轉移至15ml離心管。

加入10ml PBS清洗細胞培養盤，轉移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。再加入10ml PBS（經高壓滅菌，保存於40C），吹勻，吸取10微升進行計數，按照1×106/盤接種，在含5%CO2的細胞培養箱繼續培養。

三、細胞凍存

細胞密度達到80%～90%時，去培養基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人細胞培養箱3min。加入lmlDMEM完全培養基終止胰酶消化，轉移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細胞培養盤，轉移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。

加入lml凍存液（90%血清，10%DMSO），放入凍存盒內（盒內有異丙醇，以保證溫度降低的速度），立即放入一80℃冰箱內，過夜，第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放人液氮，可以保存三個月。

凍存液的配製：70%的完全培養基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。

注意事項

（1）進入細胞間開始細胞培養時，必須嚴格按照下列步驟操作：

①確定所有的細胞操作用的溶液和耗材都已經消毒並檢測沒有問題，不確定的溶液和耗材請勿使用，除非特殊情況，不要借用別人的溶液。

②確定衣服的袖口已經捲起或者白大褂的袖口已經扎緊。

③確定酒精燈內的酒精量，需要的話及時進行補充。

④確定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。為了方便單手開啟瓶蓋，實驗開始前可以把所有瓶蓋旋松。

⑤盡量不要直接傾倒溶液，除非瓶口沒有被燒壞。如果傾倒失敗，溶液粘在瓶口，請用噴過75%酒精的紙巾仔細清潔瓶口周圍（不要接觸到瓶口）後在火焰上簡單燒灼。

⑥操作時如果不能肯定所用的耗材是潔凈的，必須及時更換。

⑦實驗完畢及時收拾，保持工作區域清潔整齊，最後用75%酒精清潔檯面。

（2）細胞污染的預防

①實驗用品防止污染。細胞培養所用試劑、耗材、器材的清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌要仔細，並在無菌實驗檢測陰性後才能使用。操作室及剩餘的無菌器材要定期清潔、消毒、滅菌。

②操作過程防止污染。

③穿著容易起靜電或吸附灰塵的衣物必須更換為白大褂後才能進入細胞間。

④實驗開始前需要確定戴的手套沒有問題，只要接觸過生物安全櫃之外的物品，必須及時對手套進行消毒。

⑤進入細胞培養間後關好門，坐下來盡量少走動以免影響生物安全櫃的風簾。工作開始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶蓋。事先要嚴格檢查所用的器材、溶液和細胞，不要把污染品或未經消毒的物品帶入無菌室內，更不能隨便使用，以免造成大規模污染。

⑥細胞操作時動作要輕，必須在火焰周圍無菌區內打開瓶口，並將瓶口放在火焰周圍簡單轉動燒灼，注意不要讓火焰把塑料瓶口燒化。

⑦實驗操作時生物安全櫃的隔板要盡可能放低，盡量減少談話，打噴嚏或咳嗽時絕對不能對著工作區，以免造成不必要的污染。

⑧瓶蓋應當倒放在遠離自己的地方，以避免瓶蓋被誤操作所污染。

⑨不要從敞開的容器口上方經過，以避免衣服上掉落不明物體對細胞的污染。

⑩實驗操作時要注意及時更換巴斯德吸管、移液槍槍頭和移液管，切勿一根管子做到底。一旦發現接觸了非潔凈或者無法確定潔凈的物品必須直接丟棄。實驗完畢應及時收拾，保持實驗室清潔整齊，最後用75%酒精清潔檯面。

（3）防止細胞交叉污染

①在進行多種細胞培養操作時，所用器具要嚴格區分，最好作上標記便於辨別。按順序進行操作，一次只處理一種細胞，多種細胞多種操作一起進行時易發生t昆亂。

②在進行換液或傳代操作時，粘有細胞的移液槍頭和移液管不要觸及試劑瓶瓶口，以免把細胞帶到培養基中污染其他細胞。

③所有細胞一旦購置，或從別處引入，或自己建立，必須及時保種凍存，一旦發生污染可重新復甦細胞，繼續培養。

(10)細胞培養pdf擴展閱讀：

細胞培養（cell culture）是指在體外模擬體內環境（無菌、適宜溫度、酸鹼度和一定營養條件等），使之生存、生長、繁殖並維持主要結構和功能的一種方法。細胞培養也叫細胞克隆技術，在生物學中的正規名詞為細胞培養技術。

不論對於整個生物工程技術，還是其中之一的生物克隆技術來說，細胞培養都是一個必不可少的過程，細胞培養本身就是細胞的大規模克隆。細胞培養技術可以由一個細胞經過大量培養成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞，這是克隆技術必不可少的環節，而且細胞培養本身就是細胞的克隆。

細胞培養技術是細胞生物學研究方法中重要和常用技術，通過細胞培養既可以獲得大量細胞，又可以藉此研究細胞的信號轉導、細胞的合成代謝、細胞的生長增殖等。