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『壹』 《免疫的非線性模型》pdf下載在線閱讀，求百度網盤雲資源

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書名：免疫的非線性模型

作者：漆安慎

出版社：上海科技教育出版社

出版年份：1998-12

頁數：175

內容簡介：

近來，理論免疫學迅速發展。在這一領域，主要的理論工具是非線性模型.本書簡單介紹了免疫的基本知識和有關的非線性數學。本書對許多有趣的免疫學問題，例如獨特型網路調節、細胞免疫和體液免疫、免疫細胞受體庫、免疫記憶、免疫耐受以及免疫監視抗癌等均應用非線性數學模型進行了討論。

『貳』 《精編免疫學實驗指南》pdf下載在線閱讀全文，求百度網盤雲資源

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『叄』 運動改造大腦《杏仁核》

杏仁核

科普中國 | 本詞條由「科普中國」科學網路詞條編寫與應用工作項目審核

審閱專家魏大勇

杏仁核，又名杏仁體，呈杏仁狀，是邊緣系統的一部分。是產生情緒，識別情緒和調節情緒，控制學習和記憶的腦部組織，而且研究發現，幼兒自閉症似乎也與擴大的杏仁核有關。

中文名

杏仁核

外文名

amygdala

別名

杏仁體

結構

基底外側核群和皮質內側

結構

解剖

功能

研究分析

功能改善

主要神經化學遞質：

位置

杏仁核（amygdala），又名杏仁體(amygdaloid body)，位於前顳葉背內側部，海馬體和握遲芹側腦室下角頂端稍前處。主要通過外側嗅紋、終紋和腹側杏仁傳出通路，與額葉內側、眶額回、隔區、無名質、視前區、海馬體、下丘腦、丘腦、紋狀體、顳蓋皮質、島蓋皮質、頂蓋皮質、顳極、運動皮質及腦干網狀結構等段畢有雙向交互聯系。[1]

結構

一般杏仁核分為兩部，即基底外側核群和皮質內側群。

皮質內側核群形成杏仁核的背內側部。皮質內側核群包括：①前杏仁區；②外側嗅束核；③內側杏仁核；④皮質杏仁核；⑤中央杏仁核。人類的外側嗅束核最發達。基底外側核群在人腦是最大且分化最好的部分，它包括：①外側杏仁核；②基底杏仁核；③副基底杏仁核，其內側與嗅覺功能區有聯系，外側與屏狀核有聯系。其背側的一部被豆狀核所遮蓋，向後連於尾狀核。來自側嗅紋的纖維，經皮質內側核群，並沒有纖維終於基底外側核群。

基底外側核群是杏仁核的非嗅覺功能區，它接受腦干網狀結構和梨狀區皮質來的纖維旦豎可能還接受顥下回的部分纖維：杏仁核發出的纖維，大部組成終紋：自杏仁核腹側發出的纖維，向內側經豆狀核腹側，終於視前內側核、下丘腦前核、視上核團和腹內側核。自杏仁核脊側發出的纖維，向內側經豆狀核腹側，終於無名質、視前外側核團和下丘腦區、隔區、斜角核以及嗅結節等。還有部分纖維越過視前區，終於丘腦。

解剖

杏仁核是大腦基底神經核的一個重要核團,為邊緣系統的組成部分,含有13個大小不等的核團。按照其位置與功能分為基底外側核群、皮質內側核群、杏仁前區和皮質杏仁移行區4部分。杏仁核的傳入纖維主要起始於嗅球及嗅前核、基底前腦Meynert核的膽鹼能神經元、腦干、中腦腳間核、臂旁核、腦橋蘭斑、中腦中縫核及腹側背蓋、下丘腦的腹內側核、丘腦中線核群及丘腦腹後內側核等。杏仁核的大部分傳出纖維與傳入纖維呈往返聯系,一般認為杏仁核通過兩條路徑傳出信號:終紋通路,起自皮質內側核,呈弓形彎於尾核內側緣與丘腦之間,向前終止於終紋核、下丘腦(尤其是室旁核、視上核)、視前區及隔核;腹側杏仁核傳出徑路主要起自基底外側核,纖維多且散在,有些向內側止於終紋床核的內側部;有些向前止於視前區、下丘腦(腹內側核)、丘腦背內側核,繼而到額前皮質及其他皮質聯絡區[1]。此外,杏仁核內部還有十分復雜的固有纖維聯系。

功能

情緒功能

刺激清醒動物的杏仁核，動物出現「停頓反應」，顯得「高度注意」，表現迷惑、焦慮、恐懼、退縮反應或發怒、攻擊反應。刺激杏仁首端引起逃避和恐懼，刺激杏仁尾端引起防禦和攻擊反應。誘發懼—怒反應時伴瞳孔擴大、豎毛、嗥叫等情緒表現。切除杏仁核，動物出現「心理性失明」：通過視覺看到的東西不知是否可以吃，必需放到嘴裡才知道；「過度變態」：反復察看、觸摸或以口檢查各種物體，包括原先所畏懼的活蛇或活鼠；情感性行為發生顯著變化或所有的情感反應完全喪失。關於情緒反應的產生機制，有人研究認為存在兩條反射通路。（1）刺激—〉丘腦—〉扣帶回—〉大腦各區域相應皮質（長通路）；（2）刺激—〉丘腦—〉杏仁核（短通路）。長通路的刺激信息經過皮質的精細加工，利於對情緒的控制和採取適當的應對方式，短通路的刺激信息未經皮質的精細加工，速度更快，保證對恐懼刺激作出迅速反應，這對包括人在內的所有生物的生存十分重要。由此可見，杏仁核的主要功能為產生和傳入大腦新皮質的各種外界信息相適應的情緒。

學習和記憶

杏仁核是情緒學習和記憶的重要結構。和海馬一樣，杏仁核對新異刺激出現朝向反應，破壞兩側杏仁核的動物，對新異視覺刺激的朝向反應大為降低，缺乏對恐懼事件的辨識和反應。相反，在杏仁核正常的情況下，當你聽說鄰居家的狗咬傷了人，見到狗後你會感到恐懼而早早避之，盡管你未曾被它咬過。具有情緒意義的刺激會引起杏仁核電活動的強烈反應，並形成長期的痕跡儲存於腦中。因此，觸動人情緒反應強烈的事件會給人留下長期的記憶，甚至終身。

聯合注意

杏仁核的作用是負責處理面部肌肉和表情，這一功能通常被稱為「聯合注意」。其作用是當人面對一張臉時，杏仁核會對其進行掃描，辨別它是友好的還是有敵意的，以決定是面對這個人，還是逃避。杏仁核增大的幼兒都存在聯合注意方面的問題。

其他功能

杏仁核與其它皮質下中樞一樣，也是植物神經中樞，它能調節機體呼吸、心血管、胃腸道等的功能，尤其是情緒刺激伴隨的植物神經反應受杏仁核直接調控。除此外，它亦參與調節機體的性活動、攝食及調控下丘腦的作用，從而參與控制和調節垂體激素的分泌，調控神經內分泌系統功能。

研究分析

愛荷華大學（University of Iowa）的一項研究驚訝地發現，三個因大腦杏仁核受損而無所畏懼的女性志願者能夠體驗到內在的恐懼。這表明杏仁核並不是導致人害怕與驚慌的大腦區域。此前數十年針對人類和動物的研究已證明杏仁核在害怕情緒中起著很重要作用。相關研究發表在近期出版的《自然—神經科學》雜志上。

研究人員對3名大腦杏仁核受損、沒有體驗過害怕的罕見病患進行了測試。在吸入二氧化碳後，這三名患者呼吸受到刺激，產生害怕情緒並出現了恐慌性攻擊行為。其中一名患者小時候體驗過害怕，這是其第二次產生害怕的感覺。先前針對該病患以及有類似問題的病人的研究表明杏仁核受損導致病人在各種害怕刺激實驗以及威脅生命的創傷事件中，失去了害怕的感覺。Wemmie等人的這項研究表明杏仁核並不是產生害怕情緒所必需的組織結構。

研究人員仍不清楚為何唯獨二氧化碳能在杏仁核缺失的情況下刺激產生出害怕的情緒。但是，大多數能引起害怕的事物都是通過視覺與聽覺的方式被投射至杏仁核，從而被感受到。相反，高濃度的二氧化碳是被腦干中的受體感受到並導致一系列生理變化的產生，從而可能刺激到包括杏仁核在內的其他大腦區域。

功能改善

據科學家證明苯二氮，對杏仁核功能的改善有很大的好處，從基本電生理學性質，BZ對神經元電活動的影響，咪唑安定實驗方面通過試驗證明了苯二氮對杏仁核的影響，並且苯二氮一直在鎮定劑，麻醉劑，安眠葯物方面被廣泛利用。「是葯三分毒」，任何葯物的改善不如食補，酵母、肝、豆類、花生、小麥、胚芽、糙米、燕麥、小米、甘薯、捲心菜及海藻等這些富含維生素B1的食物內含有一點量的苯二氮，也滿足了人體對苯二氮的攝入。另外，多吃含維生素C較多的蔬菜、果以及含鎂較多的香蕉、葡萄、蘋果、橙子等也有利於改善大腦的功能也能很好的改善杏仁核的功能。

主要神經化學遞質：

大量實踐證明，杏仁核與情感、行為、內臟活動及自主神經功能等有關。其基礎在於杏仁核內含有多種神經化學遞質。

（1）膽鹼類（Acetylcholine）。集中在ABL，與杏仁核點燃過程有關，電刺激可使乙醯膽鹼水平上調。杏仁核是驚厥活動涉及的腦區之一，Soman中毒後，腦內乙醯膽鹼迅速在末梢區積聚，造成局部腦區的興奮而誘發驚厥。

（2）單胺類（MAO）。傳入纖維來自黑質和腹側被蓋區等部位。這與帕金森病的發病率存在顯著的性別差異一致。杏仁核內5-羥色胺(5-HT)能纖維和受體密度降低，增加ABL內5-HT，不僅具有明顯的抗抑鬱作用，還可使慢波睡眠增加和睡眠加深，由於抑鬱症病人常伴有睡眠障礙，抑鬱症狀緩解後睡眠也轉為正常，故有人認為杏仁核中5-HT功能不足可能是二者共同基礎之一。

（3）氨基酸類（Amino acid）。興奮性的谷氨酸和抑制性的GABA之間的協調平衡對杏仁核功能的正常起著重要作用。谷氨酸激活NOS使NO合成增多，NO作用於相鄰的突觸前神經末梢，激活鳥苷酸環化酶，使cGMP生成增多而產生效應。

（4）一氧化氮（NO）。杏仁核的大部分核團都含有NOS陽性神經元，其中AME和ABL的後部較多。NO與睡眠的關系資料報道有所不同。某些學者分別通過實驗，認為NO具有增加覺醒和減少慢波睡眠效應。

（5）環化核苷酸（cGMP）。杏仁核中存有大量阿片受體，激活後可使cGMP濃度升高，而生成減少。杏仁核中注射cGMP可增加覺醒，減少慢波睡眠和總睡眠時間，對快波睡眠無影響，用cGMPase抑制劑引起的效應正好與cGMP相反，說明cGMP對睡眠一覺醒的調控有重要作用。

（6）肽類（peptide）。SOM能神經活性物質可增強海馬的LTP，促進學習和記憶，臨床一些痴呆症的認知和智力障礙與腦內SOM含量下降有關。SOM能神經系統改變是Alzheimer病的特異性致病機理之一，也有人認為其功能可能是通過作用於乙酸膽鹼和去甲腎上腺素這兩種神經遞質而影響記憶過程的。

大腦中杏仁核有什麼作用

目前已知的杏仁核的功能大致可以分為三類：情緒，獎勵和記憶。

在情緒方面，杏仁核負責恐懼，悲傷等負面情緒的產生，編碼和儲存。當外界環境產生可能對生物有威脅的刺激時，杏仁核會被激活，產生相應的情緒，幫助生物識別環境中的危險。其次，當杏仁核發生異常時，患者會感受到更高的焦慮或是恐懼。有研究發現， 邊緣性人格障礙患者的左杏仁核活動多於常人，而當他們對中性的人臉進行評分時，會報告感受到更高的威脅感 [1]。

在獎勵方面，研究人員發現使用電刺激激活人的左杏仁核，會產生某種愉悅的快感[2]。而這種愉悅感參與了人行為的獎勵系統。用簡單的話來說，就是杏仁核在產生恐懼的同時也可以產生一些快感，這種快感可以促進某種行為的產生。

在記憶方面，首先杏仁核對情緒的處理本身也涉及情緒記憶的儲存[3]。以「一朝被蛇咬，十年怕井繩」為例，當一個人被蛇咬之後，他關於蛇的形狀的記憶連同對蛇的恐懼就都變成了一種情緒記憶。而當他下一次再次遇到與蛇有著相似形狀的繩子時，他的杏仁核被激活，釋放出原來的恐懼記憶，使得他再次受到驚嚇。其次，有研究也指出，杏仁核可以幫助長時記憶的加工，鞏固大腦其他部位的記憶儲存[4]。

除此之外，還有研究發現右杏仁核似乎涉及到人們對於不確定性的容忍性[5]。右杏仁核體積越大，對於不確定性的容忍度越低。

引用:

[1] Donegan NH, Sanislow CA, Blumberg HP, Fulbright RK, Lacadie C, Skudlarski P, Gore JC, Olson IR, McGlashan TH, et al. (December 2003). "Amygdala hyperreactivity in borderline personality disorder: implications for emotional dysregulation". Biological Psychiatry. 54 (11): 1284–93. doi:10.1016/S0006-3223(03)00636-X. PMID 14643096.

[2] Murray, Elizabeth A.; et al. (2009). "Amygdala function in positive reinforcement". The Human Amygdala. Guilford Press.

[3] Phelps E A, Anderson A K. Emotional memory: what does the amygdala do?[J]. Current biology, 1997, 7(5): R311-R314.

[4] Maren S (December 1999). "Long-term potentiation in the amygdala: a mechanism for emotional learning and memory" (PDF). Trends in Neurosciences. 22 (12): 561–7. doi:10.1016/S0166-2236(99)01465-4. hdl:2027.42/56238. PMID 10542437.

[5] Kanai R, Feilden T, Firth C, et al. Political orientations are correlated with brain structure in young alts[J]. Current biology, 2011, 21(8): 677-680.

參考

^2 https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S000632230300636X

^2 https://psycnet.apa.org/record/2009-02740-004

^3 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960982206001461

^4 https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0166223699014654

^5 https://web.archive.org/web/20150105164905/http://www.cell.com/current-biology/abstract/S0960-9822(11)00289-2

『肆』 生長因子及受體與癌基因有何關系

生長因子（growth
factor）受體（growth
factor
receptor）
激活的生長因子與受體結合為細胞生長提供正向的信號。我們都知道，癌症一個重要的特徵就是不能限制的細胞增殖。
樓主的問題問的很籠統
癌基因有很多種，有的是突變掉生長因子的，比如sis癌基因，突變後的受體叫PDFG，他就是一種不受限制一直處於激活狀態的生長因子，也就是說一直發出信號讓細胞不停增殖。
有的是突變受體的，受體的激活需要形成一個二聚體（dimer）信塌。
而有的癌症滑伏圓基因如neu,他的蛋白產物為Her2,這個突變的受體的跨膜結構遭到改變，結果就是他可以不結合生長因子，受體也能發生二聚dimeration，這樣就不受控制的一直使細胞生長廳碼。
還有一個例子是erbB癌症基因，他的產物蛋白石EGF,這種生長因子沒有配合基結合位點，就是沒信號，他也能自己生成二聚體，從而提供細胞生長信號

『伍』 風水方家談 《風生水起》pdf

：氣者，水之母。水者，氣之子。氣行則水隨，而水止則氣止，子母同情，水氣相逐也。夫溢於地外而有跡者為水，行於地中而無形者為氣。表裡同用，此造化之妙用，故察地中之氣趨東趨西，即其水之或去或來而知之矣。行龍必水輔，氣止必有水界。輔行龍者水，故察水之所來而知龍氣發源之始；止龍氣者亦水，故察水之所交而知龍氣融聚之處。」由此可知，山脈和河流都可以統一於 「氣」中，尋找生氣就是要觀察山川的走向。
風水術還認為，氣決定人的禍福。有土就有氣，人生得於氣，人死歸於氣。郭璞《古本葬經》論述得很詳細：「葬者，乘生氣也。夫陰陽之氣，噫而為風，升而為雲，降而為雨。行乎地中而為生氣，行乎地中發而生乎萬物。人受體於父母，本骸得氣，遺體受蔭。蓋生帆肢者，氣之聚凝，結者成骨，死而獨留、故葬者，反氣內骨，以蔭所生之道也。經雲：氣感而應鬼福及人，是以銅山西喊亂崩，靈鍾東應，木華於春，栗芽於室。氣行乎地中，其行也，因地之勢；其聚也，因勢之止。丘隴之骨，岡阜之支，氣之所隨。經曰：氣乘風則散，界水則止，古人聚之使不散，行之使有止。」 這一段話，可謂風水的總綱，而這個總綱的核心是氣。由手段話，我們可知風水師對氣的總看法：生氣是一元運化氣，在天則周流六虛，在地則發生萬物。天無此則氣無以資地，地無此則形無以載。生氣藏於地鄭轎檔中，人不可見，唯循地之理以求之。葬者若能知其所在，使枯骨得以乘之，則能得福。父母骸骨為子孫之本，子孫形體乃父母之枝，本與枝相應，得吉則神靈安、子孫盛，這叫作「氣感而應鬼福及人」。。。。。。。
以上內容希望能對你有所幫助。

『陸』 質量術語PAF是什麼意思

PAF成本模型是在預防鑒定和故障成本(PAF，Prevention，Appraisal and Failure)模型的基礎上建立的一種成本模型，用來分析成本要素。
PAF成本模型將成本分為預防成本、評價（鑒定）成本、失效（故障/損失）成本三部分，其中， 1)預防成本：預防故障的工作所需喊談返的費用；
2)評價（鑒定）成鄭飢本：為評定產品或服務是否達到質量要求而進行的試驗、檢驗和檢查費用；
3)失效（故障/損失）成本：交貨前因產品未能侍消滿足規定的質量要求所造成的損失(如：重新提供服務、重新加工、返工、重新試驗、報廢)的費用或者交貨後因產品未能滿足規定的質量要求所造成的損失的費用(如產品維護和修理、擔保和退貨、直接費用和折扣、產品回收費、責任賠償費)。

『柒』 【分子對接】AutoDock

Docking演算法需要每個原子帶有電荷並且需要標記原子的屬性。這些信息通常未包含在PDB文件中。我們需要在對蛋白和小分子的PDB文件預處理，生成PDBQT文件同時包含以上信息和PDB文件中的原子坐標信息。進一步地對於「柔性配體docking」，我們還需要定義配體的柔性部分和剛性部分。所有這些都可以通過軟體AutoDock Tools (adt)來完成。

=====准備受體蛋白=======

 

 

註：在windows下，我們可以手動棗櫻顫選擇，或者利用Excel的篩選功能。在linux下，使用命令egrep "^(ATOM|TER)" 1hsg.pdb >1hsg_prot.pdb

 

2. 啟動AutoDockTools

 

3. 依次點選File-ReadMolecule-1hsg_prot.pdb載入蛋白分子。

 

按住左鍵拖動旋轉分子結構；點擊中鍵滾動縮放；按住右鍵移動晶體位置。

 

4. 更改展示方式：依次點選Color-By Atom Type-All Geometries-OK。

 

5. 加氫：晶體結構中通常缺少氫原子的坐標 (因為氫原子電子少，且質子核對電子吸引能力弱，因此很難定位，具體見http://www.uh.e/~chembi/ChemSocRev_Jones_critical.pdf)。但是在docking過程中，氫原子尤其是極性氫原子對計算靜電作用是必須的。因此我們需要給蛋白加上氫原子，依次點選Edit-Hydrogen-Add-Polar only-OK。這時氫原子會以白頌渣色短線形式出現。

 

6. 存儲對蛋白的每個原子所做的修改和原子類型判斷：依次點選Grid-Macromolecule-Choose-1HSG_protein-Slect Molecule。ADT會彈出一個信息框包含程序所做的處理，比如合並非極性氫原子，計算原子局部電荷和判斷原子類型，並提示保存Save-1hsg_prot.pdbqt。打開文件，查看最後兩列，分別為每個原子的電量和類型 。如下圖所示分別是原始的pdb文件和新生成的pdbqt文件。

7. 在受體蛋白定義配體結合的3D搜索空間: 如果我們事先不知道結合位點，理論上可以定義一個長方體盒子包含整個蛋白或者隨便一個特定區域 。

依次點選Grid-Grid box將會在蛋白上畫出一個長方體，並且有一個彈出框。在彈出框中，拖拽刻度線查看長方體的變化，完成設置。

在這個例子中，我們知道結合位點，就選取以其為中心的一個小空間。設置Spacing (angstrom)為1埃 (這實際是一個換算系數, 相當於步長; 默認為0.375，是C-C單凳敗鍵長度的1/4，最大為1。spacing值與(各個維度上的點的數目+1)的乘機就是長方體Grid box的大小)。在我們調整的過程中，可以看到隨著這個數值的變大，立方體也被放大了。另外我們設置x,y,z center為16,25,4,number of points in (x,y,z)-dimension為30,30,30(最大為126，必須為偶數，AutoDock會自動再每一維再加一個點)。記下我們設置的這些點，下面會用到。

在刻度轉盤處點擊右鍵會彈出一個窗口，輸入數字回車即可設置GRID的中心坐標和大小。較大的number of points in (xyz)-dimension和較小的Spacing會增加搜索的精度，同時需要花費更多的計算時間。

 

8. 設置受體的柔性殘基：在ADT中依次點選Flexible Resies-Input-Choose Macromolecule-1hsg_prot; select-select from string-Resie: ARG8-Add-Dismiss, 8號ARG氨基酸殘基就被選中了。

 

再依次點選Flexible Resies-Choose Torsions in Currently Selected Resies將選擇的殘基標記為柔性殘基並設置可扭轉的數量。在分子顯示窗口中分別點擊兩個殘基上CA和CB原子之間的建，使之變為非扭轉的（紫色顯示），這樣兩個殘基中的32個鍵中有6個是可扭轉的。這里設置配體的柔性殘基或者使CA-CB的鍵為剛性都是可選操作。

Flexible Resies-Output-Save Flexible PDBQT保存柔性殘基文件。Flexible Resies-Output-Save Rigid PDBQT保存柔性殘基文件。

9. 關掉grid和刪除protein：Grid Options-File-Close w/out saving; Edit-Delete-Delete Molecule-1hsg_prot-Continue。

=====准備配體=====

蛋白結構類似，配體的結構也缺少氫原子，我們需要添加氫原子並且定義哪些鍵是可以旋轉的以用於柔性docking。從PDB結構中提取配體的原子位置。indinavir的配體殘基名字為MK1，以HETATM開頭的行表示非核心多聚體的成分 (heteroatoms)。

Linux系統下，運行grep "^HETATM.*MK1" 1hsg.pdb >indinavir.pdb

Windows系統下，直接拷貝到文件indinavir.pdb

 

3. 將結構讀入ADT；依次點選File-ReadMolecule-indinavir.pdb;Color-By Atom Type-All Geometreies-OK。

 

4. 晶體結構中通常缺少氫原子 (因為氫原子電子少，且質子核對電子吸引能力弱，因此很難定位)。但是在docking過程中，氫原子，尤其是極性氫原子對計算靜電作用是必須的。因此我們需要給配體加上氫原子，Edit-Hydrogen-Add-Polar only-OK(之所以選擇Polar only是因為vina的官方視頻裡面是這么選擇的)。這時氫原子會以白色短線形式出現。

5. 在ADT中定義此化合物為配體，以便ADT為其計算局部電荷(partialcharges)和設置可旋轉配體鍵。依次點選Ligand-input-Choose-indinavir-Select Molecule for AutoDock4。這時會有一個彈出框顯示ADT所做的操作，包括合並非極性氫(只在添加了的情況下)、計算電荷電量和設置旋轉鍵。然後點選Ligand-Output-Save as PDBQT存儲結果。

 

6. 查看ADT檢測出的旋轉鍵，依次點選Ligand-TorsionTree-Choose Torsions，可以看到Number of rotatable bonds=14/32。

====准備docking的配置文件====

docking配置文件包含了輸入的受體(蛋白)、配體(化合物)和搜索參數的信息，為一個文本文件，名字任意，可以為conf.txt，內容如下

 

receptor = 1hsg_prot.pdbqt

ligand  = indinavir.pdbqt

num_modes = 50

out = dockingResult.pdbqt

log = docking.log

center_x = 16

center_y = 25

center_z = 4

size_x = 30

size_y = 30

size_z = 30

seed = 2009

 

receptor和ligand為輸入文件的名字，與conf.txt在同一目錄下; out為輸出文件的名字；log為輸出日誌文件的名字。centerhe和size定義搜索空間的位置和大小。num_modes設置最多顯示的結合模型，鑒於只輸出符合能量值要求的結果，最後輸出的結合模型數量可能少於這一數值。seed設置隨機數生成的種子，可以為任意整數。如果想重現之前的分析結果就需要使用相同的seed。

====Docking 小分子化合物indinavir到HIV-1蛋白酶======

使用AutoDockVina執行docking預測。

 

在windows命令行提示符或linux終端下運行命令 

vina--config conf.txt，大概需要幾分鍾時間。

 

2. 輸出結果包含兩個文件，構象文件dockingResult.pdbqt和日誌文件docking.log。

dockingResult.pdbqt: 包含所有docking的模式，通常第一個為結合最好的構象，但如果前幾個能量值相差不大時也有例外。

docking.log: 日誌文件，包含結合能量值(第一列，越低越穩定，默認由低到高排序，所以第一個為最好的構象)、每個構象與第一個構象的距離、每個構象與第一個構象的差別。

====用PyMOL可視化docking結果====

 

打開PyMOL，依次點選File-Open文件類型選擇All Files-選取結果dockingResult.pdbqt文件、原始蛋白和配體的pdb文件、原教程的pdbqt文件。

 

這個是原始的蛋白受體和配體信息：

受體蛋白信息：

配體信息：

預測的配體信息：

『捌』 7. 基因工程載體

特殊用途載體

載體（Vectors）DNA：1）獨立的一個包括啟動子（promoter)、編碼區（encoding region)和終止子（terminator)的基因，or 組成基因的某個含碰元件，一般是不可以進入受體細胞的；2）採用理化方法進入細胞後，也不容易在受體細胞內維持。所以，通過不同途徑能將承載的外源DNA片段帶入受體細胞，並在其中得以維持的DNA分子稱為基因工程載體。

載體（Vectors）定義：在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進入受體細胞的DNA分子叫載體。

多克隆位點(multiple cloning site)ori復制起始點遺傳標記pUCMCSAmpr運送外源基因高效轉入受體細胞2、為外源基因提供復制能力或整合能力3、為外源基因的擴增或表達提供條件

載體的功能運送外源基因高效轉入受體細胞為外源基因提供復制能力或整合能力為外源基因的擴增或表達提供必要的條件

目的基因能否有效轉入受體細胞，並在其中維持高效表達，在很大程度上決定於載體。

基因工此老辯程對載體的要求（1）在宿主細胞內能獨立復制，ori。（2）有選擇性標記Ampr、Tetr、Kanr等。

（3）多克隆位點：外源基因插入的單一限制酶位點。（4）分子量小，可容納較大的外源基因片段。（5）拷貝數多，方便外源基因在細胞內大量擴增。外源DNA插入其中不影響載體的復制且切點是單一的，這樣可將多個外源DNA 片段插入其中。避免基因的非控制性擴散。（6）具有對受體細胞的可轉移性。（7）具有較好的安全性，不能任意轉移。

大腸桿菌質粒載體pBR322結構圖克隆位點克隆位點遺傳標記基因復制起點 

載體的種類按功能分類克隆載體克隆一個基因或DNA片斷表達載體用於一個基因的蛋白表達整合載體把一個基因插入到染色體組中

表達載體用於一個基因的蛋白表達整合載體把一個基因插入到染色體組中按來源分類質粒載體噬菌體載體柯斯質粒載體人工染色體載體00 

載體的種類和特徵質粒*   受體細胞結構插入片斷舉例E.coli   環狀＜8kb pUC18/19 , T-載體等λ噬菌體線狀

EMBL系列，λ gt系列絲狀噬菌體及噬菌粒＜10 kbM13mp系列粘粒載體35- 45kbpJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCVBAC (Bacterial Artificial Chromosome)≈300 kbPel oBAC系列YAC (Yeast Artificial chromosome )酵母細胞線性染色體kbMAC (Mammalian Artificial Chromosome)哺乳類細胞＞1000 kb病毒載體動物細胞SV40 載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體和細菌pSVK3質粒，PBV, Ti質粒

第一節克隆載體1.   質粒載體（plasimid vectors）2.   噬菌體載體（phage vectors）

第一節克隆載體1. 質粒載體（plasimid vectors）2. 噬菌體載體（phage vectors）3. 柯斯質粒載體（cosmid vectors）4. 人工染色體載體（B/Y/HAC）

質粒的生物學特性（1）質粒的概念的裸露的環狀雙鏈DNA分子，比病毒更簡單。

質粒是一種廣泛從在於細菌細胞中染色體以外的能自主的復制的裸露的環狀雙鏈DNA分子，比病毒更簡單。並不是寄主生長所必需的，但可以賦予寄主某些抵禦外界環境因素不利影響的能力（帶有抗性基因等）。

（2）質粒的大小差異很大，最小的只有1kb,只能編碼中等大小的2-3種蛋森缺白質分子，最大的達到200kb。質粒的生存在寄主細胞中「友好」地「借居」，它可以賦予寄主一些非染色體控制的遺傳性狀，以利於寄主的生存。比如，對抗菌素的抗性，對重金屬的抗性等。（3）質粒的生存

嚴緊型復制控制的質粒（stringent plasmid）(拷貝數少，為1-5個) 

（4）質粒的自主復制性質粒能利用寄主細胞的DNA復制系統進行自主復制。質粒DNA上的復制子結構決定了質粒與寄主的對應關系。根據在每個細胞中的分子數（拷貝數）多寡，質粒可分為兩大復制類型：嚴緊型復制控制的質粒（stringent plasmid）(拷貝數少，為1-5個)鬆弛型復制控制的質粒（relaxed）(拷貝數多，可達10-200個拷貝)因此，作為載體的質粒應該是鬆弛型的。

（5）質粒的不相容性兩個質粒在同一宿主中不能共存的現象稱質粒的不相容性。具有不相容性的質粒組成的群體稱為不相容群，一般具有相同的復制子。

（6）質粒的可轉移性在天然條件下，很多天然質粒都可通過細菌接合作用從一種宿主細胞內轉移到另外一種宿主內，這種轉移依賴於質粒上的tra基因產物。Conjugative plasmid 接合型質粒（自我轉移的質粒）：質粒可從一個細胞自發轉移到另一個細胞。Non Conjugative plasmid 非接合型質粒（不能自我轉移的質粒）：由於失去控制細菌配對和自我轉移的基因，質粒不能從一個細胞自發的轉移到另一個細胞。基因工程一般只能利用非接接合型質粒，保證分子操作過程中質粒在細胞中的穩定性。

Tra protein from conjugative plasmid

bom siteMob genemob mRNAMob proteinopenrecipient cellhelper plasmid即mob基因的產物可打開非接合質粒的bom 位點(oriT位點)，藉助接合質粒tra基因的產物，使非接合質粒被動遷移到受體細胞中，這種現象稱為遷移作用(mobilization)。

質粒DNA的tra基因E.Coli產生菌毛宿主與受體細胞結合遺傳物在細胞之間轉移（指令）（遷移）大腸桿菌接合（conjunction）

（7）攜帶特殊的遺傳標記野生型的質粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質抗性抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物物質合成抗生素、細菌毒素、有機鹼這些標記基因對DNA重組分子的篩選具有重要意義

遺傳標記基因定義:在基因工程中使用與選擇重組體DNA轉化細胞的基因1. 指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進入宿主細胞2. 指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子標記基因的作用

標記基因的種類1.   抗性標記基因（可直接用於選擇轉化子）

a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r，Hygr ，Neorb. 重金屬抗性基因: Cur ，Znr ，Cdrc. 代謝抗性基因: TK，抗除草劑基因2. 營養標記基因（可直接用於選擇轉化子）主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養物合成酶類的基因，這類基因在酵母轉化中使用最頻繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。3. 生化標記基因其表達產物可催化某些易檢測的生化反應，如lacZ，GUS，CAT4. 噬菌斑

1.四環素抗性基因（Tcr）Tetracycline 可結合在核糖體30s亞基中的一種蛋白質分子上，抑制核糖體的轉位過程。四環素抗性基因編碼一種399 AAs蛋白質，與細菌細胞膜結合，阻止四環素分子進入細菌細胞。2.氨苄青黴素抗性基因（Apr）Ampicillin可抑制細菌細胞膜上參與細胞壁合成酶類的活性。Apr抗性基因編碼一種分泌到細菌細胞周間質的酶，催化β-內醯胺環的水解，使氨苄青黴素失活。3. 氯黴素抗性基因（Cmr）Chlorophenicol可結合在核糖體50 S亞基上，阻止蛋白質合成。Cmr基因編碼氯黴素乙醯轉移酶，使氯黴素乙醯化，導致乙醯化的氯黴素不能結合在核糖體上。4. 卡那黴素(Kanr), 新黴素(Neor)和G418抗性(G418r)基因Kanamycin，Neomycin和G418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類抗生素，可結合在核糖體上阻止蛋白質的合成。來自轉座子Tn5和Tn903的Kanr抗性基因均可使這類抗生素磷酸化，使之不能進入細胞內。20 

質粒的存在形式有超螺旋、開環雙螺旋和線狀雙螺旋三種。

（8）質粒的存在形式質粒的存在形式有超螺旋、開環雙螺旋和線狀雙螺旋三種。雙螺旋共價閉合環（超螺旋）線狀雙螺旋（兩個裂口）開環雙螺旋（一個裂口）

質粒空間構型與電泳速率同一質粒盡管分子量相同，不同的構型電泳遷移率不同：scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。OC L SC 

天然質粒的局限性天然存在的野生型質粒由於分子量大、拷貝數低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質粒為基礎進行人工構建。

質粒載體的命名原則人工組建的質粒人工組建的質粒的第一個字母是質粒英文名字（plasmid）的第一個字元p，用小寫。p後有2個字母是大寫，表示質粒的作者和實驗室名稱，再其後為質粒的編號。如pBR322，字母p代表質粒，BR是構建該質粒的研究人員的姓名，322代表…構建的一系質粒的編號。

質粒載體的發展概況第一階段（1977年前）天然質粒和重組質粒的利用，如pSC101, ColE1, pCR, pBR313和pBR322。第二階段增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區和新的遺傳標記基因。如pUC系列載體。第三階段完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。

質粒載體的構建質粒構建基本策略1.加入合適的選擇標記基因，如兩個以上，易於選擇轉化體2.增加或減少合適的酶切位點，便於重組

3.縮短長度，提高導入效率，增加裝載量4.改變復制子，變嚴緊為鬆弛，變少拷貝為多拷貝5.根據基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件

1、選擇合適的出發質粒: Ori、選擇標記、MCS

質粒構建原則1、選擇合適的出發質粒: Ori、選擇標記、MCS2、正確獲得構建質粒載體的元件：酶切、PCR3、組裝合適的選擇標記基因4、選擇合適的啟動子5、提高外源DNA的容量滅活一些有害基因，比如與質粒移動有關的基因，或影響質粒復制的負調控基因等。6、需要滅活初始質粒上的某些編碼基因7、達到預期目的前提下，構建過程應力求簡單

質粒載體：作為基因工程載體，質粒至少應該具備復制的起始區、選擇標記基因區、多克隆位點等部分。

質粒載體的分類人工構建的質粒根據其功能和用途可分成如下幾類：高拷貝質粒突變拷貝數控制基因拷貝數1000-3000   擴增基因

高拷貝質粒突變拷貝數控制基因拷貝數 擴增基因低拷貝質粒來自pSC101 拷貝數小於10 表達某些毒性基因溫敏質粒在不同溫度下表現出拷貝數、整合等不同性質測序質粒含有測序通用引物互補序列和多酶接頭polylinker整合質粒裝有整合促進基因及位點便於外源基因的整合穿梭質粒裝有針對兩種不同受體的復制子便於基因克隆表達質粒裝有強化外源基因表達的轉錄、翻譯、純化的元件探針質粒裝有報告基因便於啟動子等元件的克隆篩選

質粒載體的分類（1）高拷貝數的質粒載體ColE1、pMB1、pMB9   鬆弛型質粒。具有低分子量、高拷貝數的優點。

具有氯黴素擴增效應：每個細胞的拷貝數1000－3000個！用途：適合大量增殖克隆基因、或需要表達大量的基因產物。

（2）低拷貝數的質粒載體（3）溫控的質粒載體由pSC101派生來的載體。特點是拷貝數低。pLG338、pLG339等

適合於克隆含量過高對寄主代謝有害的基因。減少蛋白質產物對寄主細胞的毒害。（3）溫控的質粒載體一些低拷貝基因是溫度敏感型，如pBEU1、pBEU2溫度低（<37 oC），拷貝數很少；溫度增加（>40 oC），拷貝數很快增加到>1000個。

（4）插入失活型質粒載體如pDF41、pDF42、pBR322。無抗生素抗性抗生素抗性

載體的克隆位點位於其某一個選擇性標記基因內部。外源DNA片段插入會導致選擇記號基因（如tetr、ampr、cmr等）失活。如pDF41、pDF42、pBR322。外源DNA無抗生素抗性抗生素抗性

質粒載體具有直接選擇記號並賦予寄主細胞相應的表型。只有帶有選擇標記基因的轉化菌細胞才能在選擇培養基上生長。

（5）正選擇的質粒載體質粒載體具有直接選擇記號並賦予寄主細胞相應的表型。只有帶有選擇標記基因的轉化菌細胞才能在選擇培養基上生長。可大大降低需要篩選的轉化子的數量，從而減輕實驗的工作量，提高了選擇的敏感性。通過選擇具這種表型特徵的轉化子，便可大大降低需要篩選的轉化子的數量只有帶有選擇標記基因的轉化菌細胞才能在選擇培養基上生長。目前通用的絕大部分質粒載體都是正選擇載體。具有直接選擇記號並賦予寄主細胞相應的表型，直接選擇轉化後的細胞，提高了選擇的敏感性。注意啟動子的性質，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。並能在大腸桿菌細胞中正常轉錄並轉譯成相應蛋白質的克隆載體特稱為表達載體（expression vectors）。一種典型的大腸桿菌表達型質粒載體（圖4-11）的主要組成部分，包括大腸桿菌的啟動子及操縱全點序列、多克隆位點、轉錄及轉譯信號、質粒載體的復制起點及抗菌素抗性基因。

經典的大腸桿菌質粒載體pSC101質粒載體天然質粒，屬嚴緊型低拷貝質粒。9.09 kb。四環素抗性Tetr。

ColE1天然質粒，屬鬆弛型、高拷貝質粒，6.6Kb。有氯黴素擴增效應，每個細胞拷貝

大腸桿菌素（colicin）E1和對E1免疫的基因（immE1）

選擇標記大腸桿菌素（colicin）E1和對E1免疫的基因（immE1）colicin E1能殺死不含ColE1 質粒的菌，形成噬菌斑。•colicin E1能殺死不含ColE1 質粒的菌，形成「噬菌斑」。•唯一的克隆位點EcoR I 正好位於這個基因的內部。可以通過插入失活篩選。

③不被其他細菌的colicin E1所殺死的原因

ceaimmkil結構基因免疫基因溶菌基因②殺死不含有ColE1細菌的原因cea + kil基因產物產生菌對細菌素有自身免疫性大腸桿菌所產生的細菌素稱為大腸菌素(colicin),它除作用於某些型別的大腸桿菌外,還能作用於親緣關系相近的志賀菌、沙門氏菌、克雷伯氏菌和巴氏桿菌等。③不被其他細菌的colicin E1所殺死的原因imm基因

EcoR I位於E1內部，插入外源DNA導致E1失活，使受體菌不能合成E（ColE1-），但仍表現出對E1免疫型（ImmE1+）。

唯一的克隆位點EcoR IEcoR I位於E1內部，插入外源DNA導致E1失活，使受體菌不能合成E（ColE1-），但仍表現出對E1免疫型（ImmE1+）。Colicin E1外源DNA無Colicin用對外源colicin E1的免疫性和自身不能合成colicin E1作選擇，操作非常繁雜。

pBR322：人工構建載體p:質粒；BR：質粒兩位主要構建者姓氏的第一個字母；322：實驗編號三個親本質粒：

pSF2124pMB1pSC101三個親本質粒：pMB1:出發質粒(ColE1)pSF2124: AmprpSC101: Tetr把pBR322用限制性內切酶切去某片段，換上合用的表達組件，就可以構建成工作所需的新載體。4.36kb的環狀雙鏈DNA，鹼基序列已經全部清楚。許多實用的質粒載體都是在pBR322的基礎上改建而成。可見其原型質粒在使用上有優點。

3個會導致Ampr基因失活9個導致Tetr基因失活氨苄青黴素和四環素抗性24個單一克隆位點。

pBR322的優點①雙抗生素抗性選擇標記抗生素抗性基因的插入失活效應是檢測重組體質粒的有效方法，分兩次先後選擇：沒有獲得載體的寄主細胞®在Amp或Tet中都死亡。獲得重組載體的寄主細胞®在Amp或Tet其中之一中死亡。

不含質粒載體含有空質粒載體含有重組質粒載體AmpAmp＋Tet

pBR322重組克隆的篩選重組克隆的「插入失活」篩選方法pBR322—→插入在Tetr中，基因型為Tets 、Ampr——→在含有氨卞青黴素培養基上可生長，在含有四環素培養基上不生長；pBR322—→插入在Ampr中，基因型為Tetr 、Amps、——→在含有氨卞青黴素培養基上不生長，在含有四環素培養基可生長；而在兩種抗生素培養基上都生長的是非重組型。這種在一個基因位點中插入外源DNA片段，從而使該基因活性喪失的現象叫插入失活。

②分子小，克隆能力大③高拷貝數④安全⑤具有較多的單一酶切位點（24種）

長度4363bp，易於純化，可以攜帶6-8Kb的外源DNA片段。③高拷貝數氯黴素擴增之後，每個細胞可1000~3000copies④安全失去了轉移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過接合轉移。載體越小越好。>10kb的DNA在純化過程中容易斷裂。缺失流動基因（mob）。這樣，質粒就不會從一個細菌接觸轉移到⑤具有較多的單一酶切位點（24種）

pBR322的缺點保留了轉移蛋白（mob）的作用位點。能夠被ColK質粒編碼的mob蛋白識別，如果再有F質粒的參與，就有可能轉移！

PBR322的改進①刪除mob識別位點（如質粒pBR327、pAT153等）。pAT153：從pBR322上切去HaeII片斷，既除去了mob識別位點，又增加質粒的拷貝數。

②改造EcoR I 位點pBR325：使EcoRI 也成為插入失活型位點。在pBR322位點上接入一段來自噬菌體PICm的HaeII酶切片斷（帶有氯黴素抗性基因cmlr）。cmlr上也帶一個EcoRI位點。

pUC系列載體在pBR322的基礎上改造而成。屬正選擇載體。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19

加入一個在5端帶有10個多克隆位點的基因lacZ』

（1）元件來源a .ori來自pBR322質粒的復制起點b.   標記基因（ampr）:pBR322的Ampr基因

Lacz基因編碼的半乳糖苷酶是四聚體。Lacz』基因含有lacz基因的前59個密碼子，a序列，編碼a肽。c. lacz』基因：大腸桿菌lac操縱子DNA區段，編碼β-半乳糖苷酶a-肽鏈，是LacZ氨基端的一個片段.載體用於可編碼半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主細胞。d. MCS 多克隆位點。

（2）克隆位點具有MCS（多克隆位點）區段：位於lacZ』基因的5』端。10個連續的單一限制酶切位點，但它不破壞該基因功能。

有mcs的存在，lacz』基因仍然能編碼a肽。如果外源基因插入此mcs區，該基因失活。

x-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，為生色底物，半乳糖苷酶+ x-gal   藍色

菌落藍白選擇的原理：IPTG：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，乳糖類似物，又稱為安慰誘導物，可代替乳糖誘導乳糖操縱子結構基因的表達，即可誘導lacz』所編碼的半乳糖苷酶氨基末端片段（α－肽）的合成。x-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，為生色底物，半乳糖苷酶+ x-gal藍色x－gal水解後呈現藍色

α-互補：pUC類載體帶有lacz』基因，編碼半乳糖苷酶氨基端片段（α-肽），此片段與宿主細胞所編碼的羧基端半乳糖苷酶實現基因內互補，形成有功能的半乳糖苷酶，稱α-互補。

α-互補（α-complementation）α-互補是指lacZ 基因上缺失近操縱基因區段的突變體與帶有完整的近操縱基因區段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由1024 個氨基酸組成）陰性的突變體之間實現互補。α-互補是基於在兩個不同的缺陷β-半乳糖苷酶之間可實現功能互補而建立的。大腸桿菌的乳糖lac 操縱子中的lacZ 基因編碼β-半乳糖苷酶，如果lacZ 基因發生突變，則不能合成有活性的β-半乳糖苷酶。例如，lacZ△M15 基因是缺失了編碼β-半乳糖苷酶中第個氨基酸的lacZ 基因，無酶學活性。對於只編碼N-端140 個氨基酸的lacZ 基因（稱為lacZ'），其產物也沒有酶學活性。但這兩個無酶學活性的產物混合在一起時，可恢復β-半乳糖苷酶的活性，實現基因內互補。

菌落藍白斑選擇的原理：在基因克隆時，細菌在含有IPTG和x－gal的培養基中進行培養。IPTG誘導質粒的lacz』基因產生α-肽，同時誘導細菌產生半乳糖苷酶的羧基端片段。兩種片段形成有功能的半乳糖苷酶，從而使x－gal水解，產生藍色物質，使非重組菌落呈現藍色。當外源基因插到質粒的多克隆位點後，使lacz』失活，不能表達α-肽，破壞了互補作用，細胞內無有活性半乳糖苷酶，使帶有重組質粒的細菌將產生白色菌落。

互補顯色反應 

a   具有更小的相對分子質量和更高的拷貝數，平均每個細胞可達500-700個拷貝

PUC載體的優點：a 具有更小的相對分子質量和更高的拷貝數，平均每個細胞可達個拷貝b 具有MCS片段，可把具有兩種不同粘性末端的外源DNA片段直接克隆到pUC類載體上。2.6kbc 可以用組織化學方法檢測重組體（藍白斑篩選）.

pGEM載體總長度為2743bp   含有一個氨卞青黴素抗性編碼基因和一個lacZ』編碼基因

一段含有EcoR I、Sat I、Kpn I、Ava I、Sma I、BamH I、XbaI、Sall、AccI、Hinc I、Pst II、Sph I和Hind II等識別序列的多克隆位點。此序列結構幾乎與pUC18克隆載體的完全一樣。

pGEM系列與pUC系列之間的主要差別pGEM具有兩個來自噬菌體的啟動子，即T7啟動子和SP6啟動子，它們為RNA聚合酶的附著作用提供了特異性的識別位點。由於這兩個啟動子分別位於Lac z』基因中多克隆位點區的兩側，故若在反應體系中加入純化的識別T7或SP6啟動子的RNA聚合酶，便可將已克隆的外源基因在體外轉錄出相應的mRNA。質粒載體pGEM-3Z和pGEM-4Z在結構上基本相似，兩者之間的差別僅僅在於SP6和T7這兩個啟動子的位置互換、方向相反而已。pGEM 系列與pUC 系列之間的主要差別是，它具有兩個來自噬菌體的啟動子，即T7 啟動子和SP6 啟動子，它們為RNA 聚合酶的附著提供特異性識別位點。由於這兩個啟動子分別位於lacZ『 基因中多克隆位點區的兩側，若在反應體系中加入純化的T7 或SP6 RNA 聚合酶，便可以將已經克隆的外源基因在體外轉錄出相應的mRNA 。質粒載體pGEM-3Z 和pGEM-4Z 在結構上基本相似，兩者之間的差別僅僅在於SP6 和T7 這兩個啟動子的位置互換、方向相反而已。

pGEM-3Z：多拷貝裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標記lacZ』   裝有兩個噬菌體的強啟動子用於外源基因的高效表達

注意：T7和SP6啟動子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合酶所識別，因此相應的受體菌必須表達噬菌體RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等

穿梭質粒載體這種質粒分子上含有兩個親緣關系不同的復制子結構以及相應的選擇性標記基因，因此能在兩種不同種屬的受體細胞中復制並檢測，例如既能在原核生物中復制,又能在真核生物中復制的載體。這類載體既具有細菌質粒的復制原點及選擇標記基因,還有真核生物的自主復制序列(ARS)以及選擇標記性狀通常穿梭載體在細菌中用於克隆,擴增克隆的基因,在酵母菌中用於基因表達分析.穿梭載體(shuttle vector)是指含有兩個親緣關系不同的復制子，能在兩種不同的生物中復制的。例如既能在原核生物中復制,又能在真核生物中復制的載體.這類載體不僅具有細菌質粒的復制原點及選擇標記基因,還有真核生物的自主復制序列(ARS)以及選擇標記性狀,具有多克隆位點.通常穿梭載體在細菌中用於克隆,擴增克隆的基因,在酵母菌中用於基因表達分析.61 

用Taq酶的PCR產物3』端加上了一個A。根據這一特點研製出一種線性質粒，其5』端突出的T，它們之間可以連接，即TA克隆。

When it comes to treating diseases like cancer, modern medicine has an impressive arsenal. And one of its most versatile weapons are Y-shaped proteins called monoclonal antibodies. Our immune systems already proce their own antibodies (plasma cell), they come in billions of variations, each matching a specific target, such as a particular toxin, bacteria or virus. When they bind to their target, they send a signal, this bacterium is now marked for destruction. These naturally- proced antibodies are pretty effective. In the 1970s, scientist figured out how to mass proce them.