qpcr算法失败

⑴ PCR的反应包括三个主要步骤

PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：

1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

2、模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

3、延伸：DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。

传统的Taq估计合成1000bp大概需要1分钟、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermusbrockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。有修正功能的则会比较慢。

(1)qpcr算法失败扩展阅读：

实例

优化聚合酶链式反应:

在实践中，聚合酶链式反应可以因各种原因而失败，部分原因是由于其对于污染的敏感性，导致扩增错误的DNA产物。正因为如此，人们已经开发了一些技术和步骤来优化聚合酶链式反应条件。将聚合酶链式反应前的混合物与潜在DNA污染物分开的实验室方案和流程解决了外源DNA的污染问题。

这通常包括从用于分析的区域分理出聚合酶链式反应的设定区域或者说聚合酶链式反应产物的纯化，一次性塑料制品的使用，及对反应装置之间的工作台面彻底清洁。引物的设计技术在改善聚合酶链式反应产物产率和避免杂产物的形成是很重要的。

替代缓冲成分和聚合酶的使用有助于较长或存在其他问题的DNA区域的扩增。在缓冲体系中加入试剂，如甲酰胺，或会增加聚合酶链式反应的特异性和产量。可以利用计算机模拟理论聚合酶链式反应结果（电子聚合酶链式反应），以协助在引物设计。

⑵ RNA-seq中的基因表达量计算和表达差异分析

原文链接： RNA-seq中的基因表达量计算和表达差异分析-生物知识学习 (biotechknowledgestudy.com)

差异分析的步骤：

1）比对；

2） read count计算；

3） read count的归一化；

4）差异表达分析；

背景知识：

1）比对：

普通比对： BWA，SOAP

开大GAP比对：Tophat（Bowtie2）；

2） Read count(多重比对的问题）：

丢弃

平均分配

利用Unique region估计并重新分配

表达量计算的本质

目标基因表达量相对参照系表达量的数值。

参照的本质：

（ 1）假设样本间参照的信号值应该是相同的；

（ 2）将样本间参照的观测值校正到同一水平；

（ 3）从参照的数值，校正并推算出其他观测量的值。

例如：Qpcr:目标基因表达量（循环数）相对看家基因表达量（循环数）；RNA-seq:目标基因的表达量（测序reads数），相对样本RNA总表达量（总测序量的reads数），这是最常用的标准。

归一化的原因及处理原则：

1）基因长度

2）测序量

3）样本特异性（例如，细胞mRNA总量，污染等）前两者使用普通的RPKM算法就可以良好解决，关键是第三个问题，涉及到不同的算法处理。

RNA-Seq归一化算法的意义：

基因表达量归一化：在高通量测序过程中，样品间在数据总量、基因长度、基因数目、高表达基因分布甚至同一个基因的不同转录本分布上存在差别。因此不能直接比较表达量，必须将数据进行归一化处理。

RNA-seq差异表达分析的一般原则

1）不同样品的基因总表达量相似

2）上调差异表达与下调差异表达整体数量相似（上下调差异平衡）

3）在两组样品中不受处理效应影响的基因， 表达量应该是相近的（差异不显着）。

4）看家基因可作为表达量评价依据（ 待定）

不同的算法比较：

以什么数值来衡量表达量：RPKM、FPKM、TPM

以什么作为参照标准：TMM（edgeR软件）、De seq矫正

RPKM：是Reads Per Kilobase per Million mapped reads的缩写，代表每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数。

本质：1）以reads数为计算单位；

2）对基因长度（基因间的比较）和总数据量（样本间的比较）做矫正；

1）由于可变剪切，同一基因有效转录区域长度未必相同（这个一般情况下可以不考虑，了解一下：Cufflinks软件考虑了这个问题）优化策略：外显子或转录本水平的表达量分析。

2） 使用reads数计算基因表达量有轻微误差（这里暂不展开，主要了解一下定义）优化策略：FPKM或 TPM

3） mRNA的总量未必相等。

RPKM的优化：FPKm

F = Fragment，即测序片段数量。这些片段都是从完整的cDNA打碎而来的；

本质：以文库中的片段数量为计算单位在Paired-end测序中，一个fragment就是两条PE reads构成的片段。由于是PE比对，理论上比SE比对更可靠。

T = Transcripts

本质：以转录本的条数为计算单位。使用转录本的条数（或者说：转录本的测序深度），代替reads数，在一定条件下定量更准，尤其样本间表达基因总数差异很大的时候（例如，对照样本有1万个基因表达，另外处理组仅有4000个基因表达）。

mRNA总量未必相等

mRNA总量不等——细胞本身不同

例如：活跃组织vs休眠的组织；癌细胞vs正常细胞

mRNA总量不等——污染

例如：核糖体污染外源RNA污染

解决方法——不同算法比较

其中归一化算法介绍：

1）Total Count（TC）：总reads数矫正

2）Upper Quartile（UQ）：上四分之一分位数（总reads）

矫正

3）Median（Med）；中位数（总reads数）矫正

4）Quantile (Q)：基因芯片软件limma中的校正算法；

5）RPKM：总reads数，但引入了基因长度

6）几何平均数：Deseq软件中的算法；

7）TMM：edgeR软件中的算法；

8）RPKM

逻辑1：不同位置数值的稳定性不同

四分位数quartile:将数据按从小到大排列，并分成四等分，这样得到3个分割点，第一个分割点叫做lowerquartile，第二个叫Media，第三个叫Upper quartile

很显然，极大值具有极大不稳定性，而且可能会显着影

响总体之和（假设，我们之中有个马云，我们的总收入

有什么变化？）

所以，Upper quartile和Median的数值，比总表达量之

和更加稳定，更适合作为参照。

逻辑2：表达量居中的基因的表达量值，其数值应该是相似的。

DESeq与edgeR，默认情况下都使用这一的逻辑校正。（DESeq and edgeR Bioconctor packages）

Deseq：异常高表达的基因，会显着影响细胞中的总mRNA的数量。类似的，如果样本中受到不同程度的外源RNA，如病毒、真菌等的污染，也会显着影响样本总mRNA数，导致RPMK值的误差。对于这样的问题，Deseq尝试对数据进行矫正（矫正因子），使表达量处于中间位置的基因表达量应该是基本相同的（即使用表达量处于中间的基因表达量值作为参照，而减少高表达基因的作用）。

Deseq： 校正因子=样本表达中位数/所有样本表达量中位数：回答了一个关键的问题：Deseq不同差异比较组间，计算得到的表达量值不同。因

为样本在变化，“所有样本表达量的中位数”也在变动。RPKM：总表达量为参照

Deseq：中位数为参照

TMM（edgeR）：与Deseq类似，在去除高表达基因和差异最大的基因后，TMM也是要找到一个加权系数，使剩余的基因在被矫正后差异倍数可能小。TMM的加权系数是基于两两样本比较后推算获得的（也就是两组样本的比较，将产生与这次比较相关的加权系数）。然后将所有基因除以这个加权系数，从而保证大部分表达量居中的基因表达量最相似。

不同RNA-seq表达量归一化算法的区别

Deseq类的校正算法：理论上更加稳定；但不同批次的比较会得到不同的表达量值，不利于进行多处理组/批次数据的统一分析（例如，趋势分析、共表达分析）校正会掩盖一些问题（例如：样本污染）

RPKM类的算法： 容易受异常高表达基因、外源污染等的干扰；但也更容易从结果的异常中，发现潜在问题；得到的表达量值是恒定的，多处理组/批次的数据可以合并分析。折中的方法：使用RPKM类的算法，但需要人工检查数据是否

异常。备注： Deseq软件也可以关闭校正的功能。

实际经验总结

总之：从多方面考虑，RPKM类算法，如果合理使用，依然是最优的。具体问题具体分析：在遇到问题的时候，找到问题的来源，从而给出解决方案（没有完美的流程，只有最佳解决方案）