细胞培养pdf

1. 关于CHO细胞的培养方法

CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）培养方法（正统法）
CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）培养方法（正统法）
※准备
��DMEM培养基
��PBS(-)
��Trypsin（0.25％）
��MTX（100μM）
��移液管
��自动移液枪
��废液缸
※培养基量
25c㎡��‥‥5ml
75c㎡��‥‥10ml
※操作顺序
①把培养瓶内的培养基用5ml的移液管转移到保存用的离心管里.
②用培养液量的1/2的PBS（25ml‥2.5ml）清洗细胞表面（2次）.
③再用培养液量的1/10的（25ml‥0.5ml）的胰酶冲洗细胞表面
④再CO2培养厢里静置5分钟.（利用这段时间,准备好15ml的大离心管,并也好标签做好记号.）
⑤物理方法处理,（敲击培养瓶两侧）是细胞脱离,再用显微镜确认是否完全脱离.
⑥加入等倍量的（25ml‥5ml）培养基,充分冲洗培养瓶内表面,在连同细胞全部转移到大离心管中.
⑦离心分离（1,000rpm、4℃、10min）.（这段时间准备新的培养瓶,按照9/10的量（25ml‥4.5ml）,加入培养液准备好.加入MTX的同时加入.）：50nMMTX:2.5ulof100uM/final5ml培养液（这期间,要在培养瓶表面写上细胞培养的诸多条件和细胞的种类等等.）
⑧离心分离后,为了避免沉淀细胞扩散到溶液里,要迅速将上清用吸管吸除.
⑨加入培养液(DMEM+FBS,25ml‥5ml),用移液管充分混匀细胞.
⑩按1/10量,（25ml‥0.5ml）将细胞悬浊液注入新培养瓶中.
��在CO2培养厢中37度条件下培养.培养液总量为5ml
注：使用的移液管为培养专用玻璃移液管,在上面吸口处,塞上棉花经过干热灭菌的.干热条件：180℃、3小时.
CHO细胞培养：
CHO细胞株置于RPMI1640培养基中,内含10%灭活小牛血清,青霉素100IU/mL,链霉素100IU/mL,置于37℃,5%CO2的培养箱（德国Heraeus）中培养.每隔48h换培液,当单层培养细胞汇合以后,用0.25%胰蛋白酶消化,传代培养.将培养瓶中的CHO细胞按1×105/mL传代移入培养板中,待进入对数生长期后（约24h）加药.
这是细胞的供给源:
CHO细胞由中科院上海生物化学和细胞生物学研究所提供.
这是我对此细胞的看法:
1.CHO细胞主要来源于中华仓鼠卵巢细胞.
2.与3T3(鼠纤维细胞)293(HEK)COS(猴肾细胞)HepG2(人肝细胞)C2C12(鼠肌细胞)Hl5(昆虫)AFT024(鼠基质细胞)一起,是重组DNA的主要载体细胞,常见于基因工程.
3.培养基可有多种选择,一般用RPMI1640培养基或DMEM培养基.

2. 谁有细胞传代培养具体的操作步骤和注意事项

悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用离心法后，加入新培养基后再吹打分散进行传代

贴壁细胞实验需准备超净台喷洒酒精，紫外照射30min。准备好培养瓶/皿，离心管，10%DMEM，0.25%胰酶，D-hanks液等，带上手套，口罩等，倒去旧培养基，用D-hanks液清洗一遍，去除沉积的死细胞等。

加入2ml 0.25％胰蛋白酶消化液，消化2～3min，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。加入1～2滴管含有血清的培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。

以1：2或1：3进行分装，补充新鲜培养基，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37℃CO2培养箱培养。细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。

(2)细胞培养pdf扩展阅读：

注意事项

1、传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。

2、每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。

3、如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等。

3. 如何进行细胞原代培养

原代培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。
分散细胞培养大致步骤为：将动物组织从机体中取出离散成单个细胞（常用胰蛋白酶），置合适的培养基中培养，使细胞 得以生存、生长和繁殖（注意整个过程无菌）。
组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。

4. 细胞模型的建立及培养方法有哪些

轻轻吹打,可先离心（1000rpm. 2,如要高浓度或需更换新培养基,新鲜培养基重悬沉淀,置培养瓶内轻轻摇晃: 1,吸的越干净越好,(根据配制强度经验),镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后. 一,然后收集离心（1000rpm 5min左右）,50ml培养瓶加入消化液约0；也可复苏当时离心（1000rpm 5min左右）后,以免中和后加入的消化液,轻轻振动瓶底使细胞全部脱落.在无菌台内将完全培养基加入培养瓶内,然后继续进行传代、传代培养首先进行细胞复苏,使细胞基本成单个悬浮,然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞细胞培养首先分为原代培养和传代培养、冻存,取出冻存的细胞迅速放入后交细胞面浸至水面以下不断摇动至融化,晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2分钟,24h后换液.贴壁细胞.6ml,加入完全培养基继续培养、原代培养需要从组织中消化,去除血清和死细胞,轻轻吹匀后.悬浮细胞,加入完全培养基后继续培养或实验: 对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基,加入2-3ml完全培养基后,适时换液,按此比例进行消化.PBS清洗2-3次,使强度减弱,使细胞均匀后置培养箱内培养: 1,5min左右）后加入完全培养基,完全培养基重悬培养. 2.先将水温锅调至37-38度.应遵守慢冻快融的原则；二、纯化出单细胞、分离. 细胞传代: 一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内,分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养

5. 求《动物细胞培养基本技术和特殊应用指南原书第七版》全文免费下载百度网盘资源,谢谢~

《动物细胞培养基本技术和特殊应用指南原书第七版》网络网盘pdf最新全集下载:
链接：https://pan..com/s/1AAO2105xBf5HZ3WAvinY7Q

6. 细胞培养一般方法有哪些

细胞培养首先分为原代培养和传代培养.
一、原代培养需要从组织中消化、分离、纯化出单细胞,然后继续进行传代、冻存；
二、传代培养首先进行细胞复苏:
1.应遵守慢冻快融的原则.先将水温锅调至37-38度,取出冻存的细胞迅速放入后交细胞面浸至水面以下不断摇动至融化.
2.在无菌台内将完全培养基加入培养瓶内,然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞,置培养瓶内轻轻摇晃,使细胞均匀后置培养箱内培养,24h后换液；也可复苏当时离心（1000rpm 5min左右）后,完全培养基重悬培养,适时换液.
细胞传代:
1.贴壁细胞:
对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基,吸的越干净越好,以免中和后加入的消化液,使强度减弱.PBS清洗2-3次,去除血清和死细胞,50ml培养瓶加入消化液约0.6ml,按此比例进行消化,(根据配制强度经验),晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2分钟,镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后,轻轻振动瓶底使细胞全部脱落,加入2-3ml完全培养基后,轻轻吹打,使细胞基本成单个悬浮,然后收集离心（1000rpm 5min左右）,新鲜培养基重悬沉淀,加入完全培养基后继续培养或实验.
2.悬浮细胞:
一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内,加入完全培养基继续培养,如要高浓度或需更换新培养基,可先离心（1000rpm,5min左右）后加入完全培养基,轻轻吹匀后,分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养.

7. 传代细胞的培养步骤

1、附着型胞(adherentcell)

（1）吸掉旧培养液。

（2）用D-PBS洗涤细胞一至二次。

（3）加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37℃作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用，离心后再吸掉上清液。

（4）轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。

2、悬浮型细胞(suspensioncell)

（1）吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000rpm5分钟。

（2）吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。

3、融合瘤(hybridoma)

有些hybridomacell需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基稀释细胞浓度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新培养瓶中。

(7)细胞培养pdf扩展阅读：

传代方法：

1、悬浮生长细胞传代

多采用离心法传代。1000转/分,20-30秒后去上清。沉淀细胞加新培养液后再混匀传代。亦有直接传代 法，即悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2-1/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代.

2、半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）

此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。

3、贴壁生长细胞传代

采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。

8. 《细胞实验指南上册+下册》pdf下载在线阅读全文，求百度网盘云资源

《细胞实验指南上册+下册》网络网盘pdf最新全集下载:
链接: https://pan..com/s/14hMl7_8BjZUV1b0Z84mJnQ

9. 细胞悬浮培养技术

植物细胞悬浮培养 实验方法
1.用镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入三角瓶中并轻轻夹碎。每100ml三角瓶含灭过菌MS培养基10~15ml，每瓶接种1~1.5g愈伤组织，以保证最初培养物中有足够量的细胞。
2.将已接种的三角置于旋转式摇床上。在100r/min，25~28℃条件下，进行振荡培养。
3.经6~10天培养后，若细胞明显增殖，可向培养瓶中加新鲜培养基10ml，必要时，可用大口移液管将培养物分装成两瓶，继续培养。（若细胞无明显增殖，可能是起始材料不适当，应考虑用旺盛增殖期的愈伤组织重新接种）。可进行第一次继代培养。
4.县浮培养物的过滤：按“3”法继代培养几代后，培养液中应主要由单细胞和小细胞团（不多于20个细胞）组成。若仍含有效大的细胞团，可用适当孔径的金属网筛过滤，再将过滤后的县浮细胞继续培养。
5.细胞计算。取一定体积的细胞县液，加入2倍体积的8%的三氧化铬（CrO3），置700C水浴处理15min。冷却后，用移液管重复吹打细胞悬液，以使细胞充分分散，混匀后，取一滴县液置入血细胞计数板上计数。
6.制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图：
（1）鲜重法（fresh weigh method）
在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮细胞培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。
（2）干重法（dry weigh method ）
可在称量鲜重之后，将细胞进行曲烘干，再称量干重。以干重为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制细胞干重生长曲线。
上述两种方法均需每隔2天取样一次，共取7次，每个样品重复三次，整个实验进行期间不再往培养瓶中换入新鲜培养液。
7.细胞活力的检查。对于初学者，往往需要检测活细胞的比率。可在培养的不同阶段，吸取一滴细胞县液，放在载玻片上，滴一滴0。1%的酚藏花红溶液（用培养基配制）染色，在显微镜下观察。几活细胞均不着色，而死细胞则很快被染成红色。也可用0。1%荧光双醋酸酯溶液染色，凡活细胞将在紫外光诱发下显示蓝绝色荧光，有经验的操作者，则可根据细胞形态，胞质环流判别细胞的死活。
8.细胞再生能力的鉴定：为了解悬浮培养细胞是否仍具有再生能力，可将培养细胞转移到琼脂固化的培养基上，使基再形成愈伤组织，进而在分化培养基上，诱导植株的分化。

10. 细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项

一、细胞复苏

将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。移人15ml离心管中，加入10ml预热的DMEM完全培养基，轻轻吹匀，离心，2000rpmX2min，弃上清液。

加入10ml DMEM培养基清洗，弃上清液。加入10ml DMEM完全培养基，轻轻吹打，接种于10cm盘中，在含5%CO2的细胞培养箱中培养。

二、细胞传代

细胞密度达到80%~90%时．去培养基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加人1ml DMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。

加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。再加入10ml PBS（经高压灭菌，保存于40C），吹匀，吸取10微升进行计数，按照1×106/盘接种，在含5%CO2的细胞培养箱继续培养。

三、细胞冻存

细胞密度达到80%～90%时，去培养基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加入lmlDMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。

加入lml冻存液（90%血清，10%DMSO），放入冻存盒内（盒内有异丙醇，以保证温度降低的速度），立即放入一80℃冰箱内，过夜，第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放人液氮，可以保存三个月。

冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

注意事项

（1）进入细胞间开始细胞培养时，必须严格按照下列步骤操作：

①确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶液。

②确定衣服的袖口已经卷起或者白大褂的袖口已经扎紧。

③确定酒精灯内的酒精量，需要的话及时进行补充。

④确定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。为了方便单手开启瓶盖，实验开始前可以把所有瓶盖旋松。

⑤尽量不要直接倾倒溶液，除非瓶口没有被烧坏。如果倾倒失败，溶液粘在瓶口，请用喷过75%酒精的纸巾仔细清洁瓶口周围（不要接触到瓶口）后在火焰上简单烧灼。

⑥操作时如果不能肯定所用的耗材是洁净的，必须及时更换。

⑦实验完毕及时收拾，保持工作区域清洁整齐，最后用75%酒精清洁台面。

（2）细胞污染的预防

①实验用品防止污染。细胞培养所用试剂、耗材、器材的清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌要仔细，并在无菌实验检测阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁、消毒、灭菌。

②操作过程防止污染。

③穿着容易起静电或吸附灰尘的衣物必须更换为白大褂后才能进入细胞间。

④实验开始前需要确定戴的手套没有问题，只要接触过生物安全柜之外的物品，必须及时对手套进行消毒。

⑤进入细胞培养间后关好门，坐下来尽量少走动以免影响生物安全柜的风帘。工作开始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶盖。事先要严格检查所用的器材、溶液和细胞，不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使用，以免造成大规模污染。

⑥细胞操作时动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口放在火焰周围简单转动烧灼，注意不要让火焰把塑料瓶口烧化。

⑦实验操作时生物安全柜的隔板要尽可能放低，尽量减少谈话，打喷嚏或咳嗽时绝对不能对着工作区，以免造成不必要的污染。

⑧瓶盖应当倒放在远离自己的地方，以避免瓶盖被误操作所污染。

⑨不要从敞开的容器口上方经过，以避免衣服上掉落不明物体对细胞的污染。

⑩实验操作时要注意及时更换巴斯德吸管、移液枪枪头和移液管，切勿一根管子做到底。一旦发现接触了非洁净或者无法确定洁净的物品必须直接丢弃。实验完毕应及时收拾，保持实验室清洁整齐，最后用75%酒精清洁台面。

（3）防止细胞交叉污染

①在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，最好作上标记便于辨别。按顺序进行操作，一次只处理一种细胞，多种细胞多种操作一起进行时易发生t昆乱。

②在进行换液或传代操作时，粘有细胞的移液枪头和移液管不要触及试剂瓶瓶口，以免把细胞带到培养基中污染其他细胞。

③所有细胞一旦购置，或从别处引入，或自己建立，必须及时保种冻存，一旦发生污染可重新复苏细胞，继续培养。

(10)细胞培养pdf扩展阅读：

细胞培养（cell culture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。

不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。

细胞培养技术是细胞生物学研究方法中重要和常用技术，通过细胞培养既可以获得大量细胞，又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢、细胞的生长增殖等。